N6-甲基腺苷（m6A）和5-甲基胞嘧啶（m5C）修饰对CRISPR RNA引导区域中Cas12a核酸酶活性的影响

《Bioconjugate Chemistry》：Effects of N6-Methyladenosine (m6A) and 5-Methylcytosine (m5C) Modifications in the Guide Region of CRISPR RNA on Cas12a Nuclease Activity

CRISPR-Cas12a的核酸酶活性受crRNA中m?A和m?C修饰影响有限，但m?A提升初始荧光恢复速率，m?C增强RNA-DNA双链稳定性却无显著活性变化。

　　
CRISPR-Cas12a作为新一代基因编辑工具，其应用场景已从基础研究拓展到疾病诊断和生物安全监测。本研究聚焦于指导RNA（crRNA）的化学修饰对Cas12a酶活性的影响机制，通过系统性的实验设计揭示了RNA修饰与核酸酶功能的非线性关系。

在实验设计方面，研究者构建了五组不同的crRNA样本：野生型crRNA1、含两个m6A修饰的crRNA2、以及三个位置分别引入m5C修饰的crRNA3-5。通过固相合成结合制备性凝胶电泳纯化，确保了修饰RNA的均一性。特别值得关注的是，研究团队创新性地采用双标记荧光探针（FAM-BHQ1）结合动态荧光检测技术，能够精确捕捉酶解反应的时序特征。

熔解温度（Tm）分析显示，m5C修饰的crRNA在PAM区域、中间区和靠近PAM区域引入三个甲基胞嘧啶后，Tm值分别提升4.2℃、3.9℃和2.9℃，证实该修饰能显著增强RNA-DNA双链稳定性。而m6A修饰的crRNA2虽然Tm值仅上升0.5℃，但荧光恢复速率较野生型提升17%（从2.99 RFU/sec增至3.50 RFU/sec）。这种表型与理论预测形成有趣反差——传统研究认为m6A会通过甲基氨基的空间位阻效应削弱双链稳定性，但本实验表明其可能通过其他机制影响酶活性。

通过建立四组对照实验（Cas12a+crRNA、Cas12a+靶DNA、crRNA+靶DNA、Cas12a+crRNA+靶DNA），研究首次证实完整的Cas12a-cRNA-靶DNA三元复合体才是荧光恢复的必要条件。当单独存在Cas12a或crRNA时，荧光信号无显著变化，仅在三者共同存在时出现特征性荧光恢复，这一发现为CRISPR-Cas系统激活机制提供了重要依据。

动态荧光检测揭示出关键的时间差现象：m6A修饰的crRNA2在0-7分钟内的荧光恢复速率达到3.50 RFU/sec，显著高于m5C修饰的crRNA3（2.39 RFU/sec）、crRNA4（2.05 RFU/sec）和crRNA5（1.61 RFU/sec）。这种速率差异与双链结合能存在矛盾，m5C修饰的crRNA理论上应具有更强的双链结合能力，但实际检测中其反应速率反而降低。研究团队通过引入表面等离子共振（SPR）技术进一步验证，发现m5C修饰的crRNA与Cas12a的的结合常数（Kd）较野生型提高约2.3倍，而酶切速率常数（kcat）仅下降15%，表明修饰可能通过改变酶-核苷酸复合物的构象影响催化效率。

值得注意的是，当比较不同位置修饰的效果时，m5C在PAM区域（crRNA3）的Tm提升最大（4.2℃），但荧光恢复速率仅为野生型的80%；而m5C在靠近PAM区域（crRNA5）的Tm增幅最小（2.9℃），其荧光恢复速率却达到野生型的54%。这种空间依赖性暗示，RNA修饰可能通过影响Cas12a的构象特异性结合，而非单纯依赖双链稳定性。结合已发表的Cas9系统研究，可推测m5C修饰可能通过改变RNA二级结构，影响Cas蛋白的构象转型自由能，进而调控酶活性。

本研究的重要启示在于：虽然m5C修饰能稳定RNA-DNA双链（ΔTm达4.2℃），但其对Cas12a活性的影响呈现双重性——既可能通过增强结合稳定性促进反应，也可能因空间位阻效应干扰关键构象变化。而m6A修饰虽未显著影响双链稳定性（ΔTm仅0.5℃），却展现出更优的酶活性响应速度，这可能与m6A诱导的局部甲基化构象微扰更符合Cas12a的催化界面特性有关。

该研究为CRISPR-Cas12a系统的优化提供了新思路：通过在特定位置引入m6A修饰，可在不显著影响双链结合的情况下，提升检测灵敏度。这一发现与之前关于m6A在CRISPR-Cas9系统中提升靶标识别效率的研究形成互补，共同揭示RNA修饰可通过多维度调控机制影响核酸酶活性。未来研究可进一步探索不同修饰位点的组合效应，以及修饰如何影响Cas12a的R-loop形成动力学，为开发新一代靶向递送系统奠定理论基础。