《Brain Research》：ZFP36 attenuates neuronal apoptosis and pyroptosis through inhibiting TXNIP/NLRP3 pathway in hypoxic-ischemic brain damage
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HIBD神经损伤中ZFP36通过调控TXNIP/NLRP3通路抑制炎症反应，其基因敲除加重损伤而过表达具有保护作用，机制涉及ZFP36直接降解TXNIP mRNA阻断NLRP3炎症小体激活。
郭恒江|姜艳|顾志清|李洪云|王淑萌|赵明伟|毛静文|魏荣|朱晨
上海交通大学医学院附属上海儿童医院麻醉科，上海200062，中国
摘要
缺氧-缺血性脑损伤（HIBD）是新生儿死亡和长期神经系统损伤的主要原因。神经炎症在HIBD后的神经元损伤中起着关键作用。锌指蛋白36（ZFP36）是一种能够结合腺嘌呤-尿苷富集元件（AREs）的RNA结合蛋白，具有抗炎特性，但其在HIBD中的作用尚不清楚。在本研究中，我们观察到HIBD新生大鼠的海马神经元以及经历氧-葡萄糖剥夺/再氧化（OGD/R）处理的HT22海马神经元中ZFP36表达显著上调。通过腺相关病毒（AAV）敲低ZFP36会加剧HIBD引起的海马神经元损伤、脑梗死和神经功能障碍，而通过AAV过表达ZFP36则显著改善了这些结果。类似地，在HT22细胞中敲低ZFP36会加重OGD/R诱导的神经元凋亡和焦亡，而过表达ZFP36则具有保护作用。机制上，ZFP36可以直接结合硫氧还蛋白-相互作用蛋白（TXNIP）3′-非翻译区（3′-UTR）中的ARE，TXNIP是NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体的关键激活因子，从而促进TXNIP mRNA的不稳定和降解。TXNIP的减少会损害TXNIP-NLRP3的相互作用，进而抑制HIBD中的NLRP3炎性小体激活和神经炎症。总体而言，我们的发现表明ZFP36通过抑制TXNIP/NLRP3炎性小体通路来保护神经元免受HIBD的损害，并提示ZFP36可能是HIBD的治疗靶点。
引言
新生儿缺氧-缺血性脑损伤（HIBD）是由于脑血流和氧气供应受损引起的，是新生儿神经残疾和死亡的主要原因（Huntingford等人，2024年）。在发达国家，HIBD的发病率约为每1000名新生儿中有1至4例，而在发展中国家这一比例可高达每1000名新生儿中有26例（Ranjan和Gulati，2023年）。大约25%的受影响婴儿死亡，而在幸存者中，35%会出现长期神经功能障碍，如脑瘫、癫痫、认知障碍和运动功能障碍（Estiphan等人，2024年；Finder等人，2020年；Ranjan和Gulati，2023年）。这些后果给受影响的儿童、他们的家庭和社会带来了巨大负担。尽管目前治疗HIBD的唯一确立方法是低温疗法，但它只能提供部分神经保护，仍有40-50%的接受治疗的婴儿死亡或出现严重的神经功能障碍（Bonifacio等人，2022年）。因此，迫切需要进一步阐明HIBD的发病机制并开发新的治疗策略。
HIBD的发病机制涉及复杂的机制，其中神经炎症起着核心作用（Yang等人，2024年）。NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体是一个多蛋白复合体，包括NLRP3受体、caspase-1和含有caspase招募结构域的凋亡相关斑点蛋白（ASC），已被证明在HIBD中驱动神经炎症和神经元损伤（Wang等人，2022年）。激活后，NLRP3促进caspase-1切割，导致白细胞介素（IL）-1β和IL-18的成熟，并触发GSDMD介导的焦亡（Mangan等人，2018年）。值得注意的是，无论是药物抑制还是基因敲除NLRP3都显示出对HIBD的神经保护作用（Hu等人，2022年；Qin等人，2021年），这突显了其治疗潜力。最新证据表明，在氧化应激下，硫氧还蛋白-相互作用蛋白（TXNIP）通过直接结合NLRP3成为NLRP3炎性小体的关键上游激活因子（Zhou等人，2010年）。抑制TXNIP已被证明可以抑制NLRP3的激活并减轻HIBD中的神经元损伤（Chen等人，2018年；Gamdzyk等人，2020年），这表明TXNIP/NLRP3轴是一个潜在的治疗靶点。进一步识别该通路的内源性调节因子可能有助于开发新的HIBD干预措施。
转录后调控在许多生物过程中至关重要，RNA结合蛋白（RBPs）通过控制mRNA的稳定性和降解来调节免疫反应（Fu和Blackshear，2017年）。其中，锌指蛋白36（ZFP36，也称为tristetraprolin）通过其串联锌指结构域识别目标mRNA 3′-非翻译区（3′-UTR）中的腺嘌呤-尿苷富集元件（AREs），从而导致mRNA降解（Saini等人，2020年）。ZFP36已被证明在多种神经系统疾病中具有神经保护作用，如胶质瘤和帕金森病（Sun等人，2020年；Yu等人，2023年；Zeng等人，2016年），并被认为是一种主要的炎症调节因子（Liang等人，2009年；Tiedje等人，2016年；Yadav等人，2024年）。尽管我们之前的体外研究表明ZFP36可以减轻氧-葡萄糖剥夺/再氧化（OGD/R）后的神经元损伤（Guo等人，2022年），但其在HIBD模型中的体内功能仍不清楚。
使用RNA结合蛋白数据库（RBPDB）进行的生物信息学分析显示ZFP36与TXNIP mRNA的3′-UTR具有特别高的结合亲和力，表明TXNIP可能是ZFP36的候选靶点。鉴于ZFP36已知的抗炎作用，我们推测它可能通过促进TXNIP mRNA的降解来减轻HIBD引起的神经炎症和神经元损伤，从而抑制NLRP3炎性小体的激活。因此，本研究旨在阐明ZFP36在HIBD中的保护作用及其涉及的TXNIP/NLRP3炎症通路。
动物和实验设计
所有动物实验方案均获得了上海儿童医院动物护理委员会（SHCH-IACUC-2020-XMSB-36）的批准，并按照美国国立卫生研究院的指南进行。共有163只出生后第0天（P0）的Sprague–Dawley大鼠幼崽，由上海圣昌生物科技有限公司提供（许可证编号SCXK (Hu) 2021–0002）。动物在标准实验室条件下饲养（24°C，50–60%湿度，12小时光照/黑暗周期）。
HIBD后海马神经元中ZFP36表达上调
为了研究HIBD中ZFP36的表达变化，我们通过永久性结扎左侧颈总动脉并结合缺氧建立了HIBD的新生大鼠模型。TTC染色显示HIBD大鼠存在明显的脑梗死，证实了模型的成功建立（图1A）。HIBD大鼠的海马区ZFP36的mRNA和蛋白质水平均上调，同时突触蛋白PSD95的水平下调（图1B–D）。免疫荧光染色进一步证实了这一结果。
讨论
在本研究中，我们确定了RNA结合蛋白ZFP36是一种关键的内源性神经保护分子，可以减轻HIBD中的神经元损伤和神经炎症。我们发现ZFP36在缺氧-缺血损伤后表达上调，并通过直接结合和降解TXNIP mRNA来发挥作用。TXNIP的减少有助于抑制NLRP3炎性小体的激活及其下游的炎症和焦亡途径。
作为最被广泛研究的...
结论
总之，我们证明ZFP36至少部分通过降解TXNIP mRNA来减轻HIBD，从而抑制NLRP3炎性小体的激活及其下游的炎症、凋亡和焦亡（图11）。这些发现为ZFP36介导的神经保护提供了新的机制见解，并支持其作为HIBD治疗靶点的潜力。
CRediT作者贡献声明
郭恒江：撰写——原始草稿，实验设计。姜艳：方法学。顾志清：方法学。李洪云：撰写——审阅与编辑。王淑萌：数据管理。赵明伟：数据管理。毛静文：验证。魏荣：资金获取。朱晨：项目管理和概念构思。
资助
本研究得到了上海市自然科学基金（21ZR1453000）的支持。
