原核免疫中双酶逆转录子系统的结构与机制解析

《Nature Communications》：Architecture and mechanism of a dual-enzyme retron system in prokaryotic immunity

本研究针对细菌逆转录子（Retron）系统在抗噬菌体免疫中的分子机制尚不明确的问题，聚焦于含有双组分效应器复合物（PtuA-PtuB）的I-A型逆转录子Ec78。研究人员通过冷冻电镜结构解析、生化分析和功能验证，揭示了该系统的“花篮状”四级结构组装模式，阐明了其作为毒素-抗毒素（TA）系统通过msDNA长度感应和精氨酸-赖氨酸指环构象变化来调控效应器活性的新机制，为理解原核免疫防御策略及开发基于逆转录子的生物技术工具提供了重要理论基础。

　　

在微生物与病毒永无休息的军备竞赛中，细菌演化出了五花八门的防御系统来抵御噬菌体的入侵。其中，逆转录子（Retron）作为一种独特的遗传元件，长期以来因其能够利用逆转录酶（RT）合成一种奇特的RNA-DNA杂交体（msDNA）而闻名，但其真正的生物学功能却笼罩在迷雾中。近年来，研究表明逆转录子是原核生物抗噬菌体免疫的关键成员，它们通常与特定的效应蛋白结合，构成毒素-抗毒素（TA）系统，在感知 phage 入侵后激活，通过“自杀”式的流产感染（Abi）策略保护细菌群体。然而，绝大多数逆转录子系统的分子工作机制，尤其是那些配备不止一个效应元件的复杂系统，仍是未解之谜。

发表在《Nature Communications》上的这项研究，为我们揭开了其中一类复杂系统——I-A型逆转录子Ec78的神秘面纱。与以往研究的单效应器系统（如Ec86、Sen2）不同，Ec78系统与众不同地拥有一个双组分的效应器复合物，包含一个PtuA ATP酶和一个PtuB HNH核酸酶。这种“双引擎”配置如何与逆转录子协同工作？其结构基础是什么？又是如何被精确调控以在关键时刻发挥防御作用的？为了回答这些核心问题，研究人员开展了一项整合了结构生物学、生物化学和微生物学方法的综合性研究。

研究者们首先通过细菌生长实验证实，Ec78系统确实 behaves as 一个典型的TA系统：单独表达PtuA和PtuB效应器复合物会对大肠杆菌产生强烈的毒性，导致菌落形成单位（CFU）骤降约10⁴倍；而当逆转录子（RT和msDNA）共存时，这种毒性被有效中和，细菌生长得以恢复。这表明逆转录子在此扮演了“抗毒素”的角色。进一步实验表明，无论是PtuA的ATP酶活性还是PtuB的核酸酶活性，对于效应器的毒性都是不可或缺的。有趣的是，这种毒性并非直接靶向染色体DNA，而是与细胞内tRNA^Tyr水平的显著下降相关，暗示其可能通过干扰翻译来发挥作用。

为了从原子层面理解这一系统的运作原理，研究团队利用单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）技术，成功解析了Ec78全复合物及其脱离逆转录子后的PtuAB效应器复合物的高分辨率结构。结构分析显示，Ec78全复合物呈现出一种独特的“花篮状”四级结构，总分子量达419 kDa。这个精巧的“花篮”由两个Ec78逆转录子（每个包含RT蛋白和其对应的msrRNA-msDNA杂交体）以及四个PtuA蛋白和一个PtuB蛋白组装而成。结构可被划分为A、B两个单元。在A单元中，一个逆转录子像“钩子”一样，其长长的msDNA茎环结构像一颗钉子般插入由两个PtuA二聚体形成的带正电的沟槽中，同时RT蛋白的拇指结构域与PtuA的N端结构域（NTD）紧密结合。这种多重相互作用将效应器复合物牢牢“锁”在抑制状态。而在B单元，虽然也存在一个PtuA二聚体，但其对应的msDNA茎环由于柔性较强未能被解析，并且这个单元缺少PtuB核酸酶，提示组装可能存在动态过程。

对各个组分的精细结构分析揭示了更多细节。Ec78的RT蛋白具有经典右手结构，包含 palm、thumb、finger 结构域和保守的YADD催化核心，但其拥有两个独特的环区（Loop I 和 Loop II）。PtuA蛋白是一个典型的ABC型ATP酶，但其具有独特的N端结构域（NTD）和一个环绕ATP酶结构域的“环绕 loop”，这些特征对于其与逆转录子的结合至关重要。PtuB核酸酶则包含一个N端的HNH核酸酶结构域和一个C端结构域，其催化二元体（His57和Asn73）暴露在溶剂中。

那么，效应器是如何被激活的呢？关键线索来自对游离PtuAB效应器复合物的结构解析。与全复合物中的状态相比，脱离逆转录子束缚后，PtuB核酸酶上一个被称为“精氨酸-赖氨酸指环”（arginine-lysine finger loop，β2-α3 loop）的区域变得高度柔性而无法解析。而在抑制状态下，这个环被RT蛋白上的Loop II通过氢键（如D197与Arg82、Lys83的相互作用）固定在一个伸展的构象。这种从“有序”到“无序”的转变，提示该指环是控制PtuB活性的一个关键分子“开关”。功能实验证实，截短或突变这个指环会完全废除PtuAB的毒性。

另一个核心的激活机制与msDNA的长度感知有关。此前研究提示，噬菌体编码的核酸酶可能通过降解msDNA来激活类似的系统。本研究通过构建一系列msDNA茎环截短突变体，发现当茎环长度缩短至10个碱基对（bp）或更短时，会引发显著的生长抑制，模拟了激活状态。同时，研究者在RT蛋白的palm结构域发现了一个“感应环”（sensing loop，α6-α7 loop），它接触msDNA茎环的远端，可能负责监测msDNA的完整性。一旦msDNA因 phage 攻击而被截短，这种感应机制可能触发效应器复合物从逆转录子上的释放。

尽管研究取得了重要突破，PtuAB效应器复合物的直接分子靶点仍是一个悬而未决的问题。体外实验未能检测到PtuAB对tRNA^Tyr或其他测试核酸底物的切割活性，暗示其活性可能依赖于尚未鉴定的细胞辅因子，或者通过更间接的机制导致tRNA^Tyr的消耗。

本研究综合利用了分子克隆构建表达质粒、蛋白质与核酸复合物的表达与纯化、ATP酶活性测定、细菌生长点斑实验与生长曲线分析、RT-qPCR定量tRNA水平、体外核酸切割活性测定、以及最关键的单颗粒冷冻电镜数据收集与处理、三维重构和原子模型搭建与优化等技术方法。样本来源于大肠杆菌ECONIH5菌株的Ec78系统基因座。

Ec78 system is a toxin-antitoxin system

通过功能实验证实Ec78系统是一个毒素-抗毒素（TA）系统。表达PtuAB效应器复合物导致细菌生长严重抑制，而共表达逆转录子（RT和msDNA）则能中和这种毒性。突变实验表明PtuA的ATP酶活性和PtuB的HNH核酸酶活性均为毒性所必需。细胞表型分析和RT-qPCR表明毒性可能与tRNA^Tyr降解和翻译抑制相关。

Cryo-EM structure of Ec78 system

通过冷冻电镜解析了Ec78全复合物的结构，分辨率达3.03 ?。结构揭示其呈现“花篮状”四级结构，由两个逆转录子和四个PtuA、一个PtuB组成。结构分为A、B两个单元，展示了逆转录子如何通过msDNA茎环和RT与PtuA的相互作用组装并抑制效应器。

Structure of Ec78 Retron

详细分析了Ec78逆转录子的结构。RT蛋白具有经典结构域和独特环区。msrRNA-msDNA杂交体中，msDNA形成一个长的茎环结构插入复合物核心，这与其它已知逆转录子（如Ec86）的结构显著不同。

Structure of PtuAB effectors in Ec78 complex

分析了效应器组分的结构。PtuA为ABC型ATP酶，具有独特的NTD和环绕loop。复合物中PtuA以二聚体形式存在，形成ATP结合口袋。PtuB包含HNH核酸酶结构域和C端结构域，其催化 dyad 暴露。结构比较揭示了Ec78 PtuA与I型Septu系统PtuA的差异。

Retron-mediated inhibition of PtuAB complex

阐明了逆转录子抑制效应器的分子细节。主要通过两个界面实现：msDNA-PtuA界面（msDNA茎环被PtuA二聚体的正电沟槽容纳）和RT-msrRNA-PtuA界面（RT拇指域和msrRNA与PtuA NTD结合）。PtuA的 coiled-coil 区域介导了单元间的相互作用。突变实验证实这些界面对于效应器功能和抑制至关重要。

Activation mechanism of Ec78 effector complex

通过解析ATP结合状态的PtuAB效应器复合物结构（分辨率2.70 ?），并与全复合物结构对比，揭示了激活机制。发现PtuB上的精氨酸-赖氨酸指环在效应器脱离逆转录子后发生有序到无序的转变，该环的完整性对其功能必不可少。同时，msDNA长度的缩短（模拟 phage 降解）也能触发系统激活，RT上的感应环可能参与此过程。尽管效应器靶点未在体外确定，但体内数据支持其导致tRNA^Tyr消耗。

综上所述，该研究首次在原子分辨率上揭示了一种独特的双酶逆转录子防御系统Ec78的结构与工作机制。研究描绘了一个动态的组装模型：在静息态，逆转录子作为抗毒素，通过其msDNA和RT组分与PtuA效应器的关键功能表面（如NTD、环绕loop）结合，并将调控PtuB活性的精氨酸-赖氨酸指环固定，从而抑制整个PtuAB复合物的毒性。当噬菌体感染时，其编码的因子（可能为核酸酶）可能导致msDNA被截短，这一变化被RT上的感应环感知，触发效应器复合物的释放。获得自由的PtuAB效应器中，PtuA的某些结构特征和PtuB的指环灵活性增加，可能使其能够识别并作用于细胞内的靶标（如tRNA^Tyr），最终通过破坏翻译来介导流产感染，保护细菌群体。这项研究不仅深化了我们对原核生物复杂免疫机制的理解，揭示了逆转录子TA系统调控的多样性，而且其解析的精巧分子结构也为未来设计基于逆转录子的新型基因组编辑或生物传感工具提供了宝贵的蓝图。