神经胶质生物标志物NfL和GFAP在尿液中的使用及其局限性：作为多发性硬化症的无创疾病检测指标

《Multiple Sclerosis and Related Disorders》：Usage and limitations of neuroglial biomarkers NfL and GFAP in urine as non-invasive disease markers in multiple sclerosis

尿液中的神经丝轻链（NfL）和胶质酸性蛋白（GFAP）浓度极低，大部分低于检测下限，无法显著区分多发性硬化症（MS）患者与健康对照组或不同亚型MS患者，且受尿液稀释影响显著。

　　
本研究由德国法兰克福歌德大学医院神经科团队主导，旨在评估尿液中神经丝轻链（NfL）和胶质酸性蛋白（GFAP）作为多发性硬化症（MS）生物标志物的可行性。研究采用高灵敏度 bead-based immunoassay（Simoa?）技术，通过对比MS患者与健康对照组的尿液样本，探索这些蛋白在尿液中是否具备区分疾病活动性或临床状态的价值。

### 研究背景与意义
多发性硬化症作为全球最常见的神经系统疾病之一，其病理机制涉及神经轴索损伤和星形胶质细胞活化。近年来，血液和脑脊液中NfL、GFAP等生物标志物被证实能反映神经损伤程度，但需通过侵入性采样获取。尿液的便捷性和非侵入性特性使其成为替代方案，但生物标志物在尿液中的浓度通常极低，且受肾脏功能影响显著。本研究通过预验证的Simoa?技术，首次系统评估了尿液中NfL和GFAP在MS患者中的诊断潜力。

### 研究方法与样本特征
研究纳入了79例MS患者（62例复发缓解型，17例进展型）和21例健康对照。患者样本来源于当地生物样本库，采集时间为2022年10月至2024年12月。样本处理采用标准化流程：晨尿（10ml）采集后离心分离上清液，-80℃冻存；同时采集静脉血用于血清生物标志物分析。主要技术验证包括：
1. **检测灵敏度**：NfL检测下限（LLOQ）0.466 pg/mL，GFAP为1.0 pg/mL；
2. **重复性**：NfL日内变异系数（CV）≤11.8%，GFAP≤8.0%；日间变异系数NfL≤26.8%，GFAP≤9.9%；
3. **抗干扰性**：通过质控样本验证了样本基质（尿液）对检测的影响可控。

### 关键研究结果
#### 1. 尿液生物标志物浓度普遍低于检测阈值
- **NfL**：62例RRMS患者中仅7例（11.3%）浓度在检测范围内（0.466–362.0 pg/mL），健康对照组19%样本在范围内。所有样本中约80%-85%的NfL浓度低于LLOQ。
- **GFAP**：RRMS患者中仅6例（9.7%）在检测范围内，健康对照组19%样本在范围内。约75%-82%的GFAP浓度低于LLOQ。

#### 2. 生物标志物比值（与尿肌酐比）未显示组间差异
- NfL-CR（NfL/尿肌酐）中位数RRMS组6.6×10?1?，PMS组5.1×10?1?，健康对照组6.5×10?1?（q值均>0.05）。
- GFAP-CR中位数RRMS组14.5×10?1?，PMS组10.2×10?1?，健康对照组24.4×10?1?（q值均未达显著水平）。

#### 3. 血清-尿液关联性分析
- **NfL**：血清与尿液浓度呈弱正相关（R2=0.051），但多变量分析显示尿NfL主要受尿肌酐浓度影响（标准化回归系数0.92，q<0.001）。
- **GFAP**：血清与尿液浓度无显著关联（R2=0.012），尿GFAP同样与尿肌酐浓度高度相关（R2=0.24，q=0.014）。

#### 4. 疾病活动性关联性评估
- RRMS患者中45例（72.6%）有急性复发史，18例（51.4%）MRI显示对比增强病灶。无论是否复发或存在增强病灶，尿液中NfL和GFAP浓度均无显著差异。
- 与卒中患者研究对比：相同检测方法下，尿NfL中位数17.5 pg/mL，GFAP中位数1847 pg/mL，远高于MS患者水平，提示神经损伤程度和肾脏屏障功能对尿液浓度的影响差异显著。

### 机制分析与临床启示
#### 1. 尿液浓度受限的生理学基础
- **分子过滤限制**：NfL分子量68 kDa，GFAP为50 kDa，正常肾脏滤过膜孔径约4-8 kDa，导致其生理性过滤极低。即使存在轻度肾功能障碍（ACR<30 mg/g），尿液中浓度仍难以检出。
- **尿液稀释效应**：研究显示尿肌酐浓度与NfL、GFAP浓度呈强正相关（R2=0.39-0.44），表明样本稀释程度是主要干扰因素。例如，尿肌酐浓度每升高1 mg/dL，NfL-CR可下降约14%。

#### 2. 临床应用局限性
- **诊断区分度不足**：MS组与健康对照组在尿NfL/Cr和GFAP/Cr比值上均无统计学差异（q>0.05）。
- **疾病监测价值有限**：即使对RRMS患者进行亚组分析（复发组vs无复发组、增强组vs非增强组），尿液中生物标志物浓度差异仍不显著。

#### 3. 技术改进方向
- **样本前处理优化**：研究建议采用1:2稀释替代常规1:4稀释，可能提升可检测比例，但需平衡信号强度与检测下限的冲突。
- **新型检测技术探索**：如微流控芯片（ELLA技术）或量子点传感平台，其检测下限可达0.1 pg/mL，或突破现有灵敏度瓶颈。
- **动态范围扩展**：开发适用于超低浓度的4参数校准曲线，当前研究采用的线性范围（0.466–362.0 pg/mL）对多数样本处于检测下限以下。

### 研究局限性
1. **样本量限制**：MS患者总数仅79例，且健康对照组仅21例，可能降低统计效力。
2. **血清样本不足**：健康对照组仅3例提供血清样本，削弱了血清-尿液关联性分析的可靠性。
3. **疾病异质性**：研究未区分MS亚型（如转换型、斑块型），可能掩盖特定病理状态下的尿液标志物变化。
4. **年龄干扰**：MS患者平均年龄（37.7岁）显著高于健康组（23.0岁），而NfL、GFAP均存在年龄依赖性升高趋势（文献显示每十年上升约2-3%），但本研究未进行年龄匹配分析。

### 未来研究方向
1. **扩大样本规模**：建议纳入至少200例MS患者及100例健康对照，特别关注血清NfL>20 pg/mL的高损伤组。
2. **技术创新**：评估纳米孔测序（如Oxford Nanopore）或表面等离子共振（SPR）技术对超低浓度尿液的检测能力。
3. **机制研究**：需明确尿液中NfL/GFAP的来源——是否通过肾小管主动分泌、溶血后释放或尿液浓缩效应导致。
4. **动态监测体系**：结合尿肌酐浓度校正、晨尿与随机尿对比、24小时尿收集等策略，构建标准化尿液生物标志物检测流程。

### 结论
本研究证实，在常规临床检测条件下，尿液中NfL和GFAP的浓度普遍低于现有Simoa?检测方法的检测下限，且主要受尿液稀释程度（反映肾血流量和尿生成率）影响，而非神经损伤程度。因此，当前技术条件下尿液NfL/GFAP无法作为MS诊断或监测的生物标志物。未来需开发特异性尿液检测技术，并建立结合血清和尿液的联合诊断模型，可能通过检测尿液中更高分子量片段（如完整NfL/L）或酶解产物（如β-actin裂解片段）实现突破。

该研究为神经退行性疾病尿液生物标志物开发提供了重要参考，提示未来需从分子设计（如靶向尿液稳定蛋白）、样本收集（如餐后2小时浓缩尿）、数据校正（如尿流率参数化）等多维度改进检测策略。