圈养考拉肠道微生物组、抗生素抗性组和致病性的年龄依赖性模式解析

《Communications Biology》：Age-dependent patterns of the gut microbiome, antibiotic resistome, and pathogenicity in captive koalas (Phascolarctos cinereus)

本研究针对圈养考拉肠道微生物组随年龄变化的规律及其与健康的关系尚不明确的问题，研究人员通过宏基因组学方法，对幼年、成年和老年三个年龄组的考拉粪便样本进行了分析。结果揭示了肠道细菌组和病毒组的多样性、抗生素抗性基因（ARGs）的丰度以及致病菌（如肺炎克雷伯菌K. pneumoniae和大肠杆菌E. coli）的分布均呈现显著的年龄依赖性模式，并发现可感染致病菌的裂解性噬菌体。该研究为理解圈养考拉的健康管理、抗生素耐药性风险评估以及潜在的噬菌体疗法提供了重要的科学依据。

　　

考拉（Phascolarctos cinereus）是澳大利亚特有的树栖有袋类动物，以其专食桉树叶的习性而闻名。然而，这种标志性物种正面临栖息地丧失、疾病（如衣原体病、考拉逆转录病毒）等多种威胁，使其成为濒危物种。近年来，实证研究认识到胃肠道疾病是导致考拉死亡的重要因素，这凸显了肠道微生物组在宿主生理健康中的关键作用，包括能量代谢、免疫反应等方面。圈养考拉的肠道微生物组（包括病原体和非病原体）在很大程度上受到年龄的影响，这被认为在健康和疾病中扮演着重要角色。尽管已有研究探索了考拉肠道细菌在宿主生理中的作用，但圈养个体肠道微生物组、抗性组（抵抗抗生素的基因集合）和致病性随年龄变化的动态模式仍 largely unexplored。

为了填补这一知识空白，由苏华龙、韩佩云等研究人员组成团队，在《Communications Biology》上发表了一项研究。他们采用宏基因组学方法，对来自广州长隆野生动物世界圈养考拉的75份粪便样本进行了深入分析，这些考拉根据年龄被分为幼年（1-3岁）、成年（4-6岁）和老年（7-18岁）三组。研究旨在揭示肠道细菌组（bacteriome）和病毒组（virome，主要是噬菌体）的组成、抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes, ARGs）的分布、携带ARGs的病原体（ARG-carrying pathogens, APs）及其感染病毒的年龄依赖性模式。

研究人员运用了几项关键的技术方法。他们从粪便样本中提取总DNA，使用Illumina NovaSeq 6000平台进行宏基因组测序。利用MEGAHIT对高质量测序reads进行组装，并通过MetaWRAP进行分箱（binning）和去冗余，最终获得288个物种水平的宏基因组组装基因组（Metagenome-Assembled Genomes, MAGs）。病毒序列的鉴定则基于CheckV、geNomad等工具的质量评估和分类规则，最终得到671个代表性的病毒操作分类单元（viral Operational Taxonomic Units, vOTUs）。抗生素抗性基因（ARGs）的鉴定通过将测序reads比对到SARG v3.0数据库完成。此外，研究还采用了多种生物信息学方法预测病毒宿主、分析移动遗传元件（Mobile Genetic Elements, MGEs）和毒力因子（Virulence Factors, VFs），并进行了广泛的统计学和多样性分析。

多样性和个体化的考拉肠道宏基因组组装基因组

研究人员从75份粪便样本中鉴定出288个MAGs。这些MAGs被归类为12个门下的50个细菌科。在三个年龄组中，疣微菌门（Verrucomicrobiota）和拟杆菌门（Bacteroidota）是两个最优势的菌门。细菌组的α多样性（如Shannon指数）与年龄呈负相关，随考拉年龄增长而逐渐降低。成年组的Invsimpsons、Fisher、Chao1和Richness指数均显著高于幼年和老年组。β多样性分析（NMDS和PCoA）显示，不同年龄组的样本形成了显著 distinct 的聚类，表明肠道细菌群落组成存在年龄依赖性差异。

与考拉肠道年龄相关的多样性和先前未表征的病毒基因组

研究共获得671个代表性vOTUs。病毒丰富度与年龄呈负相关，表明在衰老过程中整体丰富度逐渐下降。幼年组的Shannon、Invsimpsons和Pielou指数均显著低于成年和老年组。成年和幼年组的Fisher、Chao1和Richness指数显著高于老年组。β多样性分析同样揭示了病毒组组成的年龄依赖性转变。在病毒谱系分类中，有尾病毒纲（Caudoviricetes）是最优势的谱系。值得注意的是，绝大多数（77.31%）的vOTUs对应于多个分类等级上先前未表征的病毒。

圈养考拉肠道裂解性和溶原性病毒-宿主相互作用的年龄依赖性模式

研究确定了73个MAGs作为裂解性和溶原性病毒的宿主。随着年龄增长，裂解性病毒的丰度显著上升，而溶原性病毒和细菌宿主则显著下降。此外，病毒与微生物的丰度比率（Virus-to-Microbe Ratio, VMR）从青年到老年稳步增加，可能反映了随着年龄增长病毒复制周期的增强。这些发现表明细菌和病毒群落呈现出伴随的年龄相关动态，尽管这些关联的方向性尚未解决。

考拉肠道抗生素抗性基因谱和多样性概述

在粪便样本中共鉴定出24种ARG类型和617种ARG亚型。有趣的是，ARG丰富度与年龄呈负相关，表明在衰老过程中整体丰富度逐渐下降。这与人类肠道微生物组的研究结果（ARGs随年龄积累）形成对比。在不同年龄组中，主要ARG类型的丰度也存在差异，例如，幼年和成年组以多重耐药（multidrug resistance）为主，而老年组则以多粘菌素耐药（polymyxin resistance）为主。各年龄组还存在一些独特的ARG类型和亚型。

细菌和病毒群落中ARG推定宿主概述

为了探索ARGs的宿主，研究人员从MAGs和vOTUs序列中识别并筛选出携带ARG的contigs（ACC）。共获得465个ACCs，其中265个来自细菌contigs，200个来自病毒contigs。在细菌ACCs中，最丰富的细菌谱系是γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、拟杆菌纲（Bacteroidia）和梭菌纲（Clostridia）。在病毒ACCs中，有尾病毒纲（Caudoviricetes）是优势病毒谱系。不同宿主类别所携带的主要抗生素类别也各不相同。

携带ARG的病原体及其感染病毒的多样性和组成

通过对宏基因组序列进行病原体数据库比对，仅在研究中检测到两种病原体：肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和大肠杆菌（Escherichia coli）。这两种病原体均被鉴定为携带ARGs。肺炎克雷伯菌在幼年组中的丰度显著高于老年组。大肠杆菌在幼年组中的丰度显著高于其他两组。这两种病原体被预测对多种抗生素具有耐药性。此外，研究还发现考拉肠道共生菌，如先前被认为是关键肠道共生菌的Lonepinella koalarum，其基因组中也携带ARGs和MGEs。

ARGs、MGEs和VFs之间的交互关联

研究人员探索了MGEs和VFs丰度之间的相关性。统计分析显示，MGEs的丰度与VFs的丰度之间存在显著的正线性关系。

本研究系统揭示了圈养考拉肠道微生物生态系统（包括细菌、病毒、抗生素抗性组和致病性）随年龄变化的动态模式。研究发现，肠道细菌和病毒多样性、抗生素抗性基因的流行程度以及特定病原体的丰度均表现出显著的年龄依赖性。特别值得注意的是，幼年考拉携带更高丰度的抗生素抗性基因和机会性病原体（如肺炎克雷伯菌和大肠杆菌），这与人类研究中观察到的抗性基因随年龄积累的模式相反，提示圈养考拉幼年阶段可能是抗生素耐药性和病原体感染风险较高的关键时期。研究还发现了一种仅存在于幼年考拉中的、可感染肺炎克雷伯菌的裂解性噬菌体，以及存在于幼年和成年考拉中的、可感染大肠杆菌的溶原性噬菌体，这为未来开发针对耐药菌感染的噬菌体疗法提供了潜在的候选者。此外，移动遗传元件（MGEs）与毒力因子（VFs）之间的正相关关系，暗示了基因水平转移可能在促进毒力传播中发挥作用。

综上所述，这项研究增进了我们对圈养考拉肠道微生物组年龄依赖性模式的理解，揭示了其与抗生素耐药性和致病性的复杂关联。这些发现不仅为圈养考拉的健康管理、疾病预防和治疗（尤其是在幼年个体中）提供了重要的科学依据和风险评估工具，例如加强幼年个体的筛查和监测、探索噬菌体疗法的可能性，也为更广泛地理解野生动物微生物组随宿主年龄变化的生态和进化规律提供了有价值的见解。研究强调，未来的保护工作应充分考虑年龄因素，采取针对性的管理策略，以促进圈养濒危物种的长期生存和健康。