AQB通过双重DNA修复调控增强子宫内膜癌对卡铂的敏感性：抑制p21-E2F1-RAD51和ATF3-HDAC1-BRCA1信号通路

《Cell Death & Disease》：AQB improves carboplatin sensitivity in endometrial cancer through dual DNA repair modulation: suppression of the p21-E2F1-RAD51 and ATF3-HDAC1-BRCA1 signaling

本研究针对晚期/复发性子宫内膜癌(EC)患者对卡铂(CBPt)化疗敏感性有限及骨髓抑制等毒副作用的问题，研究人员探讨了新型小分子抑制剂AC1Q3QWB(AQB)通过表观遗传调控增强CBPt疗效的机制。研究发现AQB通过破坏HOTAIR-EZH2相互作用，上调CDKN1A(p21)、ATF3和BBC3等抑癌基因，进而双重抑制同源重组修复(HRR)通路关键分子RAD51（通过p21-E2F1轴）和BRCA1（通过ATF3-HDAC1复合物），导致DNA损伤积累、S期阻滞和细胞凋亡。体内实验证实AQB联合低剂量CBPt可显著抑制肿瘤生长并减轻骨髓抑制。该研究为改善晚期EC化疗疗效和安全性提供了新策略。

　　

子宫内膜癌(Endometrial Cancer, EC)是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一。过去三十年间，其发病率增长了132%，死亡率逐年上升，且发病呈现年轻化趋势，严重威胁女性健康。尽管手术切除和铂类化疗为大多数患者提供了有效的疾病控制手段，但对于晚期、复发性或某些罕见亚型的患者，预后仍然很差，5年生存率仅为10-19%。目前，卡铂(Carboplatin, CBPt)联合紫杉醇是晚期或复发性EC的一线治疗方案，但该方案的疗效有限，接受治疗的患者中位生存期不足3年。尽管患者初期往往对铂类化疗敏感，但多数患者在疾病进展后需要接受后续化疗。化疗药物的敏感性及其毒性反应是影响晚期或复发性EC临床疗效的重要因素。因此，开发更有效的策略以增强EC肿瘤细胞对铂类化疗的敏感性成为当务之急。

卡铂通过共价结合DNA，形成DNA交联和加合物，诱导DNA损伤，破坏正常的转录和复制，最终触发细胞凋亡。肿瘤细胞对铂类化疗药物的敏感性主要取决于其检测和修复DNA损伤的能力。双链断裂(Double-Strand Breaks, DSBs)是DNA最致命的损伤形式，铂类药物暴露后，DSB的修复主要由同源重组修复(Homologous Recombination Repair, HRR)通路介导。该通路能够在切除铂加合物后无误地修复DSBs。BRCA1在DSB形成后被招募至损伤位点，与核心重组酶RAD51相互作用并增强其活性，将其带到DSB位点，并控制DNA末端切除活性，从而对DSB修复起到关键作用。缺乏BRCA1或RAD51，或DNA修复机制受损的肿瘤细胞无法有效修复DNA损伤，因而对铂类化疗药物表现出更高的敏感性。高RAD51/BRCA1活性与铂类耐药相关，RAD51的积累被广泛用作HR功能性的生物标志物。因此，在铂类治疗诱导DNA损伤后抑制HRR，对于最大化这些药物的疗效至关重要。

长链非编码RNA(Long noncoding RNAs, lncRNAs)是人类细胞中多种过程的重要调控因子，包括细胞周期进程、耐药性、表观遗传控制、染色质重塑和肿瘤发生。lncRNA HOTAIR被报道可作为分子支架，结合并促进多梳抑制复合物2(Polycomb Repressive Complex 2, PRC2)与染色质之间的相互作用。这种相互作用通过促进组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化(Histone H3 lysine 27 trimethylation, H3K27me3)来抑制靶基因位点的转录活性，导致基因表达水平的全局性改变和抑癌基因的表观遗传抑制。PRC2的核心组分EZH2对H3K27的三甲基化至关重要。HOTAIR和EZH2在多种癌症类型中已被证实具有显著的促肿瘤作用，并且它们的表达与铂类化疗的敏感性密切相关。HOTAIR和EZH2的高表达常见于EC组织，其过表达通常与较差的患者预后相关。少数EC研究提供了初步证据，表明EZH2沉默或抑制可以增强EC细胞对顺铂的敏感性，并且也有报道称EZH2抑制可以改善化疗耐药、ARID1A功能缺失的患者来源异种移植(Patient-Derived Xenograft, PDX)模型对顺铂的反应。然而，专门靶向HOTAIR或EZH2以改善EC化疗反应的研究仍然匮乏，这凸显了一个需要进一步探索的重要领域。

在先前的研究中，本研究团队确定AC1Q3QWB(AQB)是一种靶向HOTAIR和EZH2相互作用的小分子抑制剂，它能够恢复EC中APC2、SOX17、P21、TP73、SFN、BBC3和GADD45G等抑癌基因的表达，从而抑制EC进展。选择性破坏HOTAIR-EZH2相互作用因此成为调节EC表观基因组调控，从而优化与铂类药物联合治疗策略的一种有前景的方法。

本研究观察到，在EC细胞中，AQB处理作为阻断HOTAIR-EZH2相互作用的结果，显著上调了ATF3、CDKN1A和BBC3的表达。AQB通过p21-E2F1通路抑制了CBPt诱导的RAD51上调。AQB还通过ATF3-HDAC1在BRCA1启动子区域的相互作用，表观遗传地沉默了BRCA1。AQB有效抑制了CBPt诱导的HRR活性，导致更广泛的CBPt诱导的DNA损伤、S期阻滞和肿瘤细胞凋亡。在体内，AQB增强了CBPt的抗肿瘤功效。这些发现揭示了AQB通过双重机制调控HRR通路关键分子，从而增强EC对CBPt敏感性的新机制，为晚期或复发性EC的联合治疗提供了新的思路和实验依据。该研究成果发表在《Cell Death & Disease》期刊上。

为了开展这项研究，研究人员运用了多项关键技术方法。研究纳入了127例在天津医科大学总医院接受铂类化疗的EC患者的临床数据，并收集了手术切除的EC组织样本（94例I期，7例II期，21例III期，5例IV期）用于分析。体外实验使用了HEC-1A和HEC-1B人子宫内膜癌细胞系。研究采用了细胞活力检测(CCK-8法)、集落形成实验、流式细胞术分析细胞周期和凋亡、RNA测序(RNA-Seq)、蛋白质印迹(Western Blotting, WB)、实时定量PCR(RT-qPCR)、染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)、免疫荧光(Immunofluorescence, IF)染色、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)等技术。体内研究部分，建立了皮下异种移植瘤模型和IV期EC患者来源的异种移植(PDX)模型，并进行了免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)和苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin, H&E)染色等分析。

1. AQB和CBPt治疗在体外协同抑制EC细胞活力

研究人员首先确认了AQB的化学结构。对127例EC样本的RT-qPCR分析显示，与早期（I期和II期）样本相比，晚期（III期和IV期）样本中HOTAIR和EZH2的表达水平升高，且两者表达呈正相关，在晚期样本中相关性更强。TCGA数据库分析也得出了相似结果。临床数据分析显示，接受铂类化疗的EC患者中，71.2%出现不同程度的骨髓抑制，其中29.6%为中度至重度。化疗周期越长，骨髓抑制的发生率和严重程度越高。基于这些发现以及测序数据表明AQB调控铂类耐药相关基因（如上调CDKN1A、BBC3，下调BRCA1），研究人员推测AQB可能增强CBPt敏感性。剂量反应矩阵分析显示，AQB与CBPt对CBPt不敏感的HEC-1A和HEC-1B细胞系的增殖具有协同抑制作用，AQB处理使CBPt的IC₅₀值降低至基线水平的一半左右。

2. AQB抑制HRR通路以增强CBPt敏感性

通过RNA测序分析AQB、CBPt及其联合处理HEC-1B细胞后的差异表达基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)，GO和KEGG富集分析显示，联合处理组显著富集在“双链断裂修复”、“细胞周期”、“凋亡”和“同源重组”等通路。AQB单独处理组也富集了“DNA修复调控”和“同源重组介导的双链断裂修复”等通路。qPCR检测发现，AQB处理后，EC细胞中典型HRR相关基因（RAD50, MRE11, CHK1, CHK2, RAD51）的mRNA水平显著降低。蛋白质印迹分析表明，CBPt处理增加了DNA损伤标志物γ-H2AX的水平，但同时上调了HRR相关蛋白（RAD50, MRE11, p-CHK1, p-CHK2, RAD51）；而AQB与CBPt联合处理则进一步增加了γ-H2AX水平，同时降低了HRR相关蛋白水平。免疫荧光染色证实了联合处理导致更强的γ-H2AX焦点形成和更少的RAD51焦点。时间进程实验显示AQB能持续下调RAD51并增强DNA损伤。

研究人员进一步探讨了其机制。转录因子E2F1在协调DNA修复中起核心作用。通路富集分析显示E2F1表达与EC中的DNA修复效率显著相关，且E2F1与RAD51表达呈正相关。GSEA分析显示AQB处理下调了E2F蛋白靶基因。WB证实AQB上调p21（由CDKN1A编码），并伴随磷酸化RB(p-RB)和E2F1蛋白水平的降低。敲低E2F1或AQB处理均能降低RAD51水平。而过表达E2F1则显著增加RAD51表达，并削弱了AQB对RAD51的抑制作用。ChIP实验证实AQB处理降低了RAD51启动子区域的E2F1富集。这些结果表明AQB通过上调p21，进而降低E2F1表达，最终导致E2F1调控的RAD51表达下调。

功能上，敲低CDKN1A降低了CBPt敏感性，并削弱了AQB+CBPt对细胞增殖的抑制作用和体内抗肿瘤效果。相反，敲低E2F1增强了CBPt敏感性，而过表达E2F1则降低了敏感性，并减弱了AQB+CBPt的抗增殖、促凋亡效应以及其对RAD51表达和γ-H2AX积累的调控。

3. AQB与ATF3和HDAC1相互作用实现BRCA1的表观遗传沉默

RNA测序发现AQB降低了EC细胞中BRCA1的表达。剂量和时间依赖性实验证实AQB能持续抑制BRCA1的mRNA和蛋白水平。DEGs分析显示AQB处理显著富集了“DNA结合转录抑制活性”、“转录辅调节活性”等通路，其中ATF3是最显著的差异基因之一。AQB处理以剂量依赖方式上调了ATF3的mRNA和蛋白水平，同时伴随BRCA1的下调。ChIP分析证实AQB处理降低了ATF3启动子区域的H3K27me3富集，表明ATF3的上调是AQB介导的表观遗传去抑制的结果。

敲低ATF3导致BRCA1表达上调，而过表达ATF3则显著降低BRCA1表达。ChIP实验显示AQB处理后，ATF3在BRCA1启动子区域的富集增加。蛋白质相互作用图谱提示ATF3与HDAC1存在联系，Co-IP实验证实了ATF3与HDAC1的结合。ChIP分析进一步显示，AQB处理后BRCA1启动子区域的HDAC1富集增加，而敲低ATF3则消除了这种富集。同时，HDAC1的表达水平不受AQB浓度、ATF3敲低或过表达的影响。这些结果支持了AQB上调的ATF3招募HDAC1至BRCA1启动子，形成转录抑制复合物的模型。ChIP检测BRCA1启动子组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化(H3K27ac)水平，发现AQB处理后H3K27ac占有率下降，而敲低ATF3则阻止了这种下降。敲低HDAC1或ATF3均能消除AQB对BRCA1的抑制作用，且联合敲低引起BRCA1更大幅度的上调，表明AQB介导的BRCA1抑制依赖于ATF3-HDAC1轴。

功能上，敲低ATF3降低了CBPt敏感性，并减弱了AQB+CBPt的抗增殖、促凋亡效应以及DNA损伤积累。体内实验也证实敲低ATF3削弱了AQB+CBPt的抗肿瘤功效。

4. AQB增强CBPt诱导的EC细胞S期阻滞

GSEA分析显示AQB处理负调控细胞周期和细胞生长通路。流式细胞术细胞周期分析发现，CBPt处理诱导了EC细胞的S期阻滞，而AQB与CBPt联合处理则显著增强了这种S期阻滞。WB分析显示，与CBPt单独处理组相比，联合处理组S期阻滞相关蛋白CDK2、Cyclin A和Cyclin E1的表达下调。CCK-8和集落形成实验证实，AQB与CBPt联合应用对EC细胞增殖的抑制作用显著强于单药处理。

5. AQB与CBPt联合促进EC细胞凋亡

RNA测序分析发现AQB调控多种凋亡相关基因，其中促凋亡基因BBC3(PUMA)被上调。qPCR证实AQB以剂量依赖方式上调BBC3的mRNA水平。ChIP实验显示AQB处理降低了BBC3启动子区域的H3K27me3富集。WB分析表明，AQB与CBPt联合处理显著增加了PUMA蛋白水平，以及下游促凋亡蛋白Bax和凋亡效应蛋白cleaved caspase-3的水平。流式细胞术显示联合处理诱导的细胞凋亡率显著高于单药处理。免疫荧光染色也观察到联合处理后cleaved caspase-3信号增强。敲低BBC3降低了CBPt敏感性，并减弱了AQB+CBPt的抗增殖作用和体内抗肿瘤效果。

6. AQB治疗在体内增强CBPt敏感性并减轻骨髓抑制

在HEC-1B细胞皮下移植瘤模型中，与单药处理相比，AQB与CBPt联合治疗显著抑制了肿瘤生长，肿瘤体积和重量减小更明显。IHC分析显示联合治疗组肿瘤组织中增殖标志物Ki67以及HRR相关蛋白RAD51和BRCA1的表达水平低于CBPt单独处理组。IF染色显示联合治疗组肿瘤细胞核内γ-H2AX焦点和cleaved caspase-3阳性信号更强。

为了评估AQB在降低CBPt剂量方面的潜力，研究人员比较了全剂量CBPt(50 mg/kg)与半剂量CBPt(25 mg/kg)联合AQB的治疗效果。结果显示，AQB联合半剂量CBPt产生的抗肿瘤效果与全剂量CBPt单药治疗相当甚至更优，且IHC显示Ki67表达显著降低。

为进一步模拟患者肿瘤环境，研究人员利用IV期EC患者的肿瘤组织建立了PDX模型。H&E染色证实PDX模型与原代肿瘤组织学特征高度相似。在该模型中，AQB联合半剂量CBPt治疗组的抗肿瘤活性与全剂量CBPt单药治疗组相似。在治疗期间，各组小鼠体重无显著差异。血常规检测显示，在全剂量CBPt组，治疗第21天白细胞(WBC)和中性粒细胞(NEU)计数显著低于对照组，而血小板(PLT)计数在第7、14、21天均显著降低。相比之下，AQB联合半剂量CBPt组与对照组相比，在这些时间点的WBC、NEU和PLT计数均无显著差异。其他血常规参数及肝肾功能指标、组织病理学检查均未发现显著异常，表明联合治疗减轻了CBPt相关的骨髓抑制，且未引起明显的器官毒性。

本研究系统地阐明了新型小分子抑制剂AQB通过表观遗传调控双重抑制HRR通路关键分子RAD51和BRCA1，从而增强子宫内膜癌对卡铂化疗敏感性的分子机制。AQB通过破坏HOTAIR-EZH2相互作用，一方面上调p21，抑制E2F1-RAD51信号轴；另一方面上调ATF3，进而招募HDAC1至BRCA1启动子，通过降低组蛋白乙酰化水平沉默BRCA1转录。这种双重抑制作用导致DNA损伤修复能力显著下降，DNA损伤积累，进而引发S期细胞周期阻滞和细胞凋亡。体内研究不仅证实了AQB与CBPt联合应用的显著抗肿瘤效果，更重要的是，发现AQB能够允许降低CBPt的使用剂量，从而有效减轻其主要的剂量限制性毒性——骨髓抑制，这在临床PDX模型中得到了验证。

该研究的发现具有重要的科学意义和临床转化潜力。首先，它揭示了HOTAIR/EZH2轴在调控EC铂类化疗敏感性中的关键作用，并阐明了其通过调控p21-E2F1-RAD51和ATF3-HDAC1-BRCA1这两条新颖信号通路影响HRR的具体机制，深化了对EC化疗耐药表观遗传调控网络的理解。其次，研究证实靶向HOTAIR-EZH2相互作用的小分子抑制剂AQB能够有效逆转EC的铂类耐药，为克服临床化疗耐药提供了新的策略和候选药物。第三，研究首次报道了ATF3通过招募HDAC1表观遗传沉默BRCA1的这一新机制，拓展了ATF3在DNA损伤应答和肿瘤化疗敏感性中的功能认知。最后，也是最具临床价值的一点是，研究证明了AQB与低剂量CBPt联合方案在保持抗肿瘤活性的同时，能够显著减轻骨髓抑制，这为改善晚期/复发性EC患者的治疗耐受性、提高生活质量、以及可能延长治疗周期提供了实验依据。此外，研究的初步数据提示AQB可能与PARP抑制剂等其他HRR靶向药物产生协同效应，预示着其更广泛的应用前景。总之，该研究为开发针对晚期子宫内膜癌的、更有效且更安全的联合化疗策略奠定了坚实的理论基础，并展示了良好的转化医学价值。