《Gene Reports》：IDENTIFICATION of NLP-5 and NLP-6 as potential ligands for the NPR-9 receptor in
Caenorhabditis elegans
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本研究通过基因突变和转基因表达分析，发现C. elegans中的NLP-5和NLP-6神经肽可能作为NPR-9受体的潜在配体，影响运动行为（漫游和栖息）及脂肪积累调控机制。
作者：Foroozan Torki、William G. Bendena、Ian D. Chin-Sang
加拿大安大略省金斯顿女王大学生物系，邮编K7L 3N6
摘要
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中的神经肽通过与其G蛋白偶联受体（GPCRs）的相互作用，调节对环境信号的生理和行为反应，从而影响运动、进食和脂肪储存。秀丽隐杆线虫表达多种神经肽，包括FMRFamide相关肽、神经肽样肽（NLPs）和胰岛素样肽（INSs）。其中，位于AIB中间神经元中的galanin/allatostatin样GPCR NPR-9通过抑制AIB的活性来调节运动行为（游走和停留）和脂肪积累。最近的研究确定NLP-1是NPR-9的配体，可通过直接与受体相互作用来调节行为。然而，我们的研究探讨了其他神经肽（特别是NLP-5和NLP-6，即allatostatin A型/galanin样神经肽）是否也能作为NPR-9的配体，尽管有证据表明NLP-1是主要配体。在本研究中，我们描述了与NPR-9受体功能相关的表型特征，包括Omega转角、游走行为和脂肪积累。nlp-5、nlp-6和nlp-1的功能丧失突变体表现出与npr-9突变体相似的行为特征，这表明NLP-5和NLP-6可能作为NPR-9的额外配体或影响NPR-9的信号传导。
背景
神经肽是动物界中最古老和最多样化的信号分子之一。它们作为神经调节剂、神经递质或神经激素，精细调节神经元活动，并调控广泛的生理和行为过程（Husson等人，2007年；Li，2005年；Emerson和Lee，2022年）。秀丽隐杆线虫表达大约300种神经肽，这些神经肽由160个神经肽基因编码（Li和Kim，2008年；Holden-Dye和Walker，2013年；Marks等人，2010年；Watteyne等人，2024年）
结果
NLP-5和NLP-6在ASI感觉神经元中表达（见图1）：ASI感觉神经元整合环境信号并调节秀丽隐杆线虫的神经内分泌输出。ASI与表达NPR-9的AIB中间神经元形成直接的突触连接（Shi，2022年）。这种解剖学上的邻近性表明，从ASI释放的神经肽（如NLP-5和NLP-6）可能直接在AIB上发挥作用，从而调节行为。因此，在ASI中鉴定潜在的配体支持ASI–AIB之间的信号传导
结论
本研究证实NLP-5和NLP-6是galanin/allatostatin样受体NPR-9的潜在配体，与先前发现的配体NLP-1一起。先前的异源去配体化实验（Golinelli等人，2025年）表明，在HEK293细胞中NPR-9可直接被NLP-1激活，但不会被NLP-5或NLP-6激活，这表明这些肽可能需要额外的体内共因子或神经元环境才能激活受体（Golinelli，2024年）。我们提供了支持这一结论的证据
材料与方法
秀丽隐杆线虫的培养：所有秀丽隐杆线虫菌株均在含有大肠杆菌OP50的培养基（NGM）平板上培养，培养条件为20°C（遵循1991年的标准程序进行染色体外培养和转化序列的整合）。除非另有说明，否则通过次氯酸盐漂白或定时产卵来同步线虫的年龄。所有实验均以野生型Bristol N2菌株作为参考。本研究中使用的突变体和转基因菌株列表见
转基因系的生成
通过标准显微注射技术将目的基因插入年轻成年雌雄同体秀丽隐杆线虫的生殖腺中生成转基因系。为了研究nlp-5和nlp-6的共表达，在pJH499质粒中构建了含有特定基因启动子区域的转录报告基因。为了观察表达情况，分别注射了nlp-5p::GFP和nlp-6p::mCherry转录报告基因（每种100 ng/μL），同时注射odr-1p::RFP（10 ng/μL）作为共标记物。根据表达情况选择转基因系
转基因表达的验证
使用配备40×和63×油浸物镜的Zeiss LSM 710共聚焦显微镜检测nlp-5p::GFP和nlp-6p::mCherry的荧光表达。激发波长分别为488 nm（GFP）和561 nm（mCherry），图像采集使用ZEN 2010软件。通过合并的z-stack投影进行共定位分析。在预期的神经元群体（ASI、IL2等）中观察到强烈的荧光，从而确认了转基因表达
基因分型
通过PCR检测编辑/删除区间内的突变等位基因和野生型等位基因。扩增产物在2–3%的琼脂糖凝胶上进行分离。当可用时，使用限制性片段长度多态性（RFLPs）或熔解曲线基因分型（HRM）来提高检测效率。
游走行为分析：游走行为的测定方法参照Bendena等人（2008年）（Gallagher等人，2013年；Kim等人，2011年）的方法，并进行了少量修改。具体操作为：将单条线虫放置在OP50培养基上
未引用的参考文献
Barson等人，2010年；Badie-Mahdavi等人，2005年；Song和Kim，2016年；Gan，2015年；McCloskey等人，2017年；xxxx；xxxx；xxxx；xxxx；xxxx；xxxx。
CRediT作者贡献声明
Foroozan Torki：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、结果验证、方法学设计、实验实施及数据分析。
William G. Bendena：负责撰写、审稿与编辑、结果验证、实验监督、资源协调、项目管理、方法学设计、实验实施及资金获取。
负责撰写、审稿与编辑、结果验证、实验监督、项目管理、方法学设计、实验实施及资金获取、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
