西马脑炎病毒识别VLDLR的结构机制揭示：多价结合模式与受体嗜性决定因素

《Nature Communications》：Structural insights into VLDLR recognition by western equine encephalitis virus

本研究针对西马脑炎病毒（WEEV）受体识别机制不清的问题，通过冷冻电镜技术解析了WEEV加州株与极低密度脂蛋白受体（VLDLR）LA1-3复合物的高分辨率结构（3.03 ?），发现LA1和LA2插入E2-E1异源二聚体形成的裂隙，LA3和LA5结合E1-DIII区，首次揭示WEEV通过多价结合模式识别VLDLR。研究进一步发现E2蛋白第181位氨基酸（K181/E181）是决定病毒受体嗜性的关键分子开关，为理解甲病毒进化及抗病毒策略开发提供新见解。

　　

在病毒学领域，甲病毒作为一类由节肢动物传播的正链RNA病毒，长期以来对全球公共卫生构成严重威胁。其中，西马脑炎病毒（Western Equine Encephalitis Virus, WEEV）作为脑炎型甲病毒的重要成员，不仅在马群中引发致命性脑炎，更可通过气溶胶传播导致人类出现从流感样症状到严重脑炎的不同临床表现。令人担忧的是，感染后幸存者可能面临癫痫、瘫痪和智力障碍等永久性神经系统后遗症。然而令人困惑的是，自首次分离WEEV以来，其爆发规模和哺乳动物致病性显著下降，这种"潜伏"现象与病毒受体使用方式的改变密切相关。

当前研究表明，高致病性的WEEV A组毒株（如California、Fleming等）能够同时利用人类极低密度脂蛋白受体（VLDLR）、载脂蛋白E受体2（ApoER2）和原钙粘蛋白-10（PCDH10）作为入侵受体，而毒性较弱的B组和C组毒株则主要依赖PCDH10。特别值得注意的是，Imperial-181等毒株甚至无法有效利用上述任一受体。这种受体使用差异背后的结构基础是什么？病毒如何通过进化调整其受体识别策略？这些问题成为理解WEEV致病机制和进化轨迹的关键科学难题。

针对这一挑战，由清华大学、中国科学技术大学和武汉病毒研究所等单位组成的研究团队在《Nature Communications》上发表了题为"Structural insights into VLDLR recognition by western equine encephalitis virus"的重要研究成果。该研究通过综合运用结构生物学、生物化学和细胞生物学方法，首次揭示了WEEV加州株与VLDLR相互作用的精细结构基础，阐明了病毒采用的多价结合模式，并鉴定出决定受体嗜性的关键分子开关。

关键技术方法包括：利用昆虫细胞表达系统制备WEEV病毒样颗粒（VLP）；采用哺乳动物细胞表达系统获得VLDLR不同结构域（LA重复序列）的重组蛋白；通过冷冻电镜（cryo-EM）技术解析复合物结构；运用生物层干涉技术（BLI）和酶联免疫吸附试验（ELISA）定量分析结合亲和力；利用假型病毒系统进行细胞感染实验验证功能。

冷冻电镜解析WEEV与VLDLR复合物结构

研究人员首先通过冷冻电镜技术解析了WEEV加州株VLP与VLDLR配体结合域（LBD，包含LA1-8）的复合物结构。对称性扩展和局部重构结果显示，在病毒表面的q3尖刺处出现了额外的密度，对应于结合的LA重复区域。与游离病毒相比，复合物结构中两个连续的LA重复插入相邻E2-E1异源二聚体形成的裂隙中，位于E2 A结构域的倾斜支架上。

绘制WEEV与VLDLR LA重复的结合图谱

为精确鉴定哪些LA重复参与WEEV识别，研究团队表达了单个LA重复（LA1-Fc至LA8-Fc）并通过BLI和ELISA评估其与WEEV VLP的结合能力。结果显示，LA1、LA2、LA3和LA5与病毒具有强结合亲和力，KD值分别为0.11 nM、1.59 nM、6.09 nM和0.37 nM，而LA4、LA6、LA7和LA8几乎不结合。细胞实验进一步证实，表达这些结合性LA重复的K562细胞能够有效促进假型病毒感染。

VLDLR LA1-3与WEEV相互作用的精细结构

研究团队选择高亲和力的LA1-3构建体进行高分辨率结构分析，获得了3.03 ?分辨率的复合物结构。结构显示，LA1和LA2的EF样模体作为钙离子结合位点，钙离子螯合对于复合物稳定性至关重要——加入钙离子特异性螯合剂EGTA可完全破坏结合。在相互作用界面，LA1的酸性残基（D53、D55、E56和D57）与E1的K227形成强静电互补区域，而LA2的残基（R88、W89、P95、D92、D94和D96）与E2的K181、K190和R214形成多个氢键和盐桥。点突变实验证实这些关键残基对病毒识别至关重要。

LA3和LA5结合位点的映射

尽管冷冻电镜密度不足以构建原子模型，但局部重构显示LA3和LA5结合于WEEV E1蛋白的DIII区域。BLI实验证实LA3-His和LA5-His与WEEV加州株E1-DIII-Fc直接相互作用，亲和力分别为829.6 nM和808 nM，表明这两种LA重复通过靶向E1-DIII促进病毒感染。

VLDLR与WEEV的多价结合特性

通过评估不同串联体与WEEV的结合亲和力，研究发现LA1-5具有最强结合力（KD=0.41 μM），优于LA1-3（0.47 μM）和LA1-2（1.63 μM）。这种协同增强效应表明LA3和LA5结合于不同于LA1/LA2的表位。有趣的是，完整LBD（LA1-8）的亲和力（1.21 μM）反而低于LA1-5，提示非结合性LA重复（LA6-8）可能产生空间位阻。

WEEV受体嗜性的决定因素

序列比对发现，能够利用VLDLR/ApoER2的A组毒株在E2蛋白181位为赖氨酸（K），而不能利用这些受体的毒株多为谷氨酸（E）。点突变实验证实，加州株的E2K181E突变完全丧失与VLDLR结合能力，而Imperial-181株的逆向突变E2E181K则获得结合能力。此外，研究还发现Fleming毒株特有的E2K81也参与VLDLR识别，Imperial-181的E2E81K突变同样赋予其VLDLR利用能力。细胞感染实验验证这些突变显著改变病毒的受体偏好性。

研究结论与讨论部分强调，该研究系统阐明了WEEV识别VLDLR的多价结合模式：LA1和LA2插入E2-E1异源二聚体裂隙，而LA3和LA5结合E1-DIII区域。这种多重结合策略不仅增强亲和力，也为病毒受体使用进化提供灵活性。特别重要的是，E2蛋白第181位氨基酸作为关键的分子开关，单个突变即可根本改变病毒受体嗜性，这为理解WEEV"潜伏"现象提供分子解释。

与近期报道的WEEV Fleming株和东部马脑炎病毒（EEEV）与VLDLR结合模式比较，加州株展现出独特的结合特征，反映甲病毒为优化受体识别采用的多样化进化策略。尽管LA3和LA5的结合模式与猿猴泡沫病毒（SFV）有相似之处（均靶向E1-DIII），但具体相互作用细节存在差异。

该研究不仅深化了对甲病毒入侵机制的理解，更重要的是鉴定出病毒表面保守且关键的受体结合表位，为广谱抗病毒药物和疫苗设计提供新靶点。未来研究可进一步探索病毒进化与受体使用的相互作用关系，以及针对这些保守表位的抑制剂开发策略，为应对新发再发病毒性传染病提供科学基础。