新一代tRNA间隔双向导RNA CRISPR系统实现大规模遗传相互作用筛选

《Nature Communications》：A next-generation dual guide CRISPR system for genetic interaction library screening

本研究针对现有CRISPR/Cas9双向导RNA系统存在的克隆繁琐、错误配对率高和表达不平衡等问题，开发了基于tRNA间隔的新一代双导系统。该系统通过单步克隆策略实现高效建库（错误配对率仅2%），在结直肠癌细胞中成功筛选10万对遗传相互作用，精准识别了包括旁系同源基因对（如CNOT7/8、ASF1A/B）在内的合成致死组合，为癌症联合疗法开发提供了强大技术平台。

　　

在精准医疗时代，联合疗法已成为癌症治疗的基石，能够有效降低副作用、增强疗效并克服耐药性。然而，人类基因组中潜在遗传相互作用的组合数量极其庞大，传统筛选方法效率低下，限制了系统性发现新型药物组合的能力。CRISPR/Cas9基因编辑技术的出现为大规模遗传筛选提供了强大工具，但实现双基因扰动仍面临技术瓶颈：现有双启动子系统存在克隆步骤繁琐、向导RNA（gRNA）错误配对率高（可达50%）、两个gRNA表达不平衡等问题。虽然采用正交CRISPR系统（如Cas12a）可简化克隆流程，但其编辑效率通常低于常用的化脓链球菌Cas9（SpCas9），且需要更多gRNA进行有效敲除。

为解决这些挑战，Thomas Burgold等人在《Nature Communications》发表研究，开发了一种基于tRNA间隔的新一代双导CRISPR系统。该系统利用细胞内源性tRNA加工机制实现高效双gRNA表达，仅需单步克隆即可构建包含10万对gRNA的文库，错误配对率低至2%，且两个gRNA活性高度平衡。研究人员在HT-29结直肠癌细胞中成功验证了该系统筛选遗传相互作用的能力，识别出多个已知合成致死对，包括旁系同源基因CNOT7/CNOT8和ASF1A/ASF1B。这项技术为大规模遗传相互作用研究提供了高效平台，有望加速癌症联合疗法的开发。

关键技术方法包括：采用人甘氨酸tRNA间隔序列构建双gRNA表达盒；通过Gibson组装将寡核苷酸池克隆至慢病毒载体；使用HT-29结直肠癌细胞系（来源：Sanger研究所细胞模型资源库）进行文库筛选；通过高通量测序分析gRNA丰度变化；利用GEMINI算法计算遗传相互作用得分；采用流式细胞术和细胞生长成像进行阵列验证。

研究团队首先通过精心设计的载体构建验证了tRNA间隔系统的有效性。将针对BFP报告基因和SNCA基因的gRNA分别置于载体两个位置，高通量测序显示编辑效率达88-96%，与单gRNA载体相当，且不受位置影响。缩短tRNA前导序列从30nt至6nt不影响效率，但完全去除会导致上游gRNA活性部分丧失，最终确定6nt前导序列为最优设计。

在文库构建方面，193bp的双gRNA表达盒可直接化学合成，通过单步Gibson组装克隆至慢病毒载体。为提高特异性扩增并减少分子内重组，研究团队在载体两个位置采用不同gRNA支架：位置1使用野生型（WT）或两种改良支架（Mod6、Mod7），位置2使用改进型支架。对包含8914个gRNA对的试点文库分析显示，克隆后文库分布均匀（基尼系数0.19），正确配对率达87.1%（允许一个错配），显著优于传统方法。

为优化筛选条件，研究人员在HT-29细胞中测试了不同gRNA支架的表现。结果显示，使用改良支架（M6、M7）的载体在区分必需基因与非必需基因方面表现更优（Cohen's D值：M6=3.46，M7=3.34），且两个位置的gRNA活性高度相关（Pearson R：M7=0.92）。必需基因召回曲线下面积（AUC）达0.98-1.0，与单gRNA筛选效果相当。值得注意的是，靶向基因间区的gRNA对相比非靶向gRNA对细胞活力有轻微影响，提示双链断裂毒性需在实验对照中考虑。

在大规模筛选中，研究团队构建了包含100,136个gRNA对的遗传相互作用文库，其中40个锚定基因与444个文库基因配对。克隆后分析显示正确配对率高达88.8%，错误配对率仅1.95%。慢病毒生产过程中重组率略有增加（至3.8-5.0%），但通过双端测序仍可准确识别gRNA对。筛选结果证实，已知必需基因显著耗竭（Cohen's D=2.05），且与单gRNA筛选数据高度相关（R²=0.79）。

通过GEMINI算法分析，研究成功识别出显著遗传相互作用。旁系同源基因对（如HDAC1/HDAC2、MAPK1/MAPK3）显示合成致死效应，与已有报道一致。从BioGRID数据库筛选的遗传相互作用对也得到验证，包括BRAF-EGFR、BCL2L1-MCL1等与结直肠癌相关的通路组合。这些相互作用在多个gRNA对中表现一致，证实了结果的可靠性。

阵列验证实验进一步证实了筛选结果。分别敲除CNOT7/CNOT8或ASF1A/ASF1B单个旁系同源基因对细胞生长影响微弱，但同时敲除两个基因导致生长和活力显著下降。Western blot验证了蛋白敲低效果。共竞争实验通过流式细胞术分析显示，双敲细胞群比例随时间显著下降，而对照非必需基因对无此效应，排除了系统假阳性的可能。

该研究开发的tRNA间隔双导系统解决了现有技术的多个瓶颈，为SpCas9系统的大规模遗传相互作用筛选提供了高效平台。其单步克隆策略、低错误配对率和平衡的gRNA表达，使研究人员能够利用已有的大量Cas9表达细胞系和优化指南进行筛选。未来，该技术可应用于遗传缺失文库构建、碱基编辑筛选、单细胞CRISPR屏幕等多个领域，特别是在iPSC衍生细胞、原代细胞等复杂系统中具有广阔应用前景。最重要的是，这项技术将促进癌症治疗候选组合的发现，并推动人类基因组遗传相互作用图谱的绘制。