单细胞RNA测序揭示成纤维细胞异质性并鉴定CLOCK为纤维化皮肤病的关键调控因子

《Scientific Reports》：Single?cell RNA sequencing reveals fibroblast heterogeneity and identifies CLOCK as a key regulator in fibrotic skin diseases

本研究针对纤维化皮肤病机制不清、治疗手段匮乏的现状，通过单细胞RNA测序技术深入解析了正常皮肤、瘢痕、瘢痕疙瘩和硬皮病中成纤维细胞的异质性。研究发现不同疾病状态存在特异性成纤维细胞亚群，并首次鉴定出CLOCK作为瘢痕疙瘩的关键调控因子，其表达上调可促进成纤维细胞增殖和迁移。该研究为理解纤维化发病机制提供了新的细胞分子见解，为开发靶向治疗策略奠定了重要基础。

　　

皮肤纤维化是一类以细胞外基质过度沉积和成纤维细胞异常增殖为特征的疾病，严重影响全球数百万人的健康。尽管瘢痕疙瘩、硬皮病等纤维化皮肤病临床常见，但其发病机制尚未完全阐明，有效治疗手段十分有限。传统观点认为成纤维细胞是形态功能均一的细胞群体，但近年研究发现其存在显著异质性，这种异质性在疾病发生发展中可能发挥关键作用。

为解决这一科学问题，陆军军医大学第一附属医院等单位的研究人员在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果。研究人员整合分析了来自公共数据库的20例人类皮肤样本的单细胞RNA测序数据，涵盖正常皮肤、瘢痕、瘢痕疙瘩和硬皮病四种状态。通过对78,330个细胞进行系统分析，揭示了纤维化皮肤病中复杂的细胞组成特征。

研究首先通过UMAP聚类识别出14个主要细胞簇，包括内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等11种经典细胞类型。值得注意的是，不同疾病状态的细胞组成存在明显差异：正常皮肤以角质形成细胞为主，瘢痕疙瘩富含内皮细胞，而瘢痕组织则以成纤维细胞为主要成分，提示不同纤维化状态具有独特的微环境特征。

Identification of diseases specific fibroblast among four skin fibrotic states

研究人员进一步对17,647个高质量成纤维细胞进行深入分析，通过系统发育聚类树将其划分为17个亚群。通过比较各亚群在四种疾病状态中的分布比例，成功鉴定出四种疾病特异性成纤维细胞亚群：正常皮肤相关的PLCG2_Fibroblast、瘢痕疙瘩相关的P311_Fibroblast、瘢痕相关的GPX3_Fibroblast以及硬皮病相关的APCDD1_Fibroblast。

功能富集分析显示，这些特异性成纤维细胞亚群具有不同的生物学特征。PLCG2_Fibroblast主要富集在热反应和蛋白质折叠通路；P311_Fibroblast与细胞外基质重建、骨化和软骨发育相关；GPX3_Fibroblast参与细胞外基质组织和体液免疫反应；而APCDD1_Fibroblast则与Wnt信号通路和间充质发育密切相关。这些发现与相应疾病的临床表现高度吻合。

Interaction networks of fibroblasts among individual microenvironments

为探究疾病特异性微环境中成纤维细胞的相互作用网络，研究人员利用CellChat分析了细胞间通讯模式。结果显示，P311_Fibroblast在正常皮肤组织中作为主要信号输出源，在瘢痕疙瘩组织中同时承担信号接收和传递的关键角色。在瘢痕组织中，GPX3_Fibroblast是最强的信号发送者，而巨噬细胞是主要信号接收者。

特别值得注意的是，在瘢痕疙瘩样本中，P311_Fibroblast特异性分泌LAMININ、MIF、SEMA6和WNT等细胞相互作用信号通路；而在硬皮病样本中，APCDD1_Fibroblast特异性分泌CLDN和WNT信号。这些发现揭示了不同疾病状态下成纤维细胞亚群通过特异性信号通路与微环境中其他细胞类型进行通讯的分子机制。

Identification the key transcription regulator of individual specific sub-fibroblasts

通过SCENIC分析，研究人员进一步揭示了各特异性成纤维细胞亚群的关键转录调控因子。结果显示，RUNX3是硬皮病特异性APCDD1_Fibroblast的关键调控因子，IRF4是瘢痕组织GPX3_Fibroblast的命运决定因子，HOXC4是正常皮肤PLCG2_Fibroblast的主要调控因子。

最为重要的是，研究发现CLOCK在瘢痕疙瘩特异性P311_Fibroblast中具有极高的特异性评分，其表达显著倾向于该亚群。伪时间轨迹分析显示，P311_Fibroblast位于整个分化轨迹的末端，而CLOCK表达在伪时间末端呈现较高水平。进一步分析发现，CBX3、CBX5、CNN3等基因的表达模式与CLOCK高度一致，提示这些基因可能受CLOCK调控并在P311_Fibroblast的分化和功能中发挥关键作用。

Decreased CLOCK inhibited fibroblast proliferation and migration

为验证CLOCK的生物学功能，研究人员通过siRNA技术敲低成纤维细胞中的CLOCK表达。功能实验结果表明，CLOCK敲低显著抑制了成纤维细胞的迁移能力和增殖活性，而对细胞凋亡没有明显影响。

进一步对TCGA数据库的分析显示，CLOCK及其调控基因在皮肤 cutaneous melanoma(SKCM)中表达上调，且在转移性肿瘤中表达水平进一步升高。这些发现强调了CLOCK及其相关基因在皮肤纤维化、肿瘤发展和转移过程中的重要作用。

本研究采用的关键技术方法包括：从GEO等公共数据库获取单细胞RNA测序数据并使用Seurat软件包进行质控和标准化处理；通过UMAP进行降维聚类和细胞类型鉴定；利用CellChat分析细胞间通讯网络；应用SCENIC识别转录调控因子；使用Monocle3进行伪时间轨迹分析；通过体外细胞实验验证基因功能。

研究结论与讨论部分指出，该研究首次在单细胞水平系统揭示了纤维化皮肤病中成纤维细胞的异质性特征，并鉴定出CLOCK作为瘢痕疙瘩的关键调控因子。 circadian clock(生物钟)基因CLOCK的异常表达与成纤维细胞的增殖迁移能力密切相关，这为理解纤维化疾病的发病机制提供了新的视角。同时，研究发现CLOCK及其下游基因在皮肤肿瘤和转移灶中表达上调，提示其在肿瘤进展中可能发挥重要作用。

尽管该研究存在样本来源多样性有限、缺乏直接功能验证等局限性，但其发现为纤维化皮肤病的精准治疗提供了潜在靶点。未来研究需要进一步扩大样本规模，深入验证各调控因子的功能机制，并探索其与临床表型的相关性，为最终实现纤维化疾病的个性化治疗奠定基础。