中国婴儿低磷酸酯酶症新发现：ALPL基因新型复合杂合突变的鉴定与功能表征

《Human Genome Variation》：Infantile hypophosphatasia in a Chinese patient: identification and characterization of novel compound heterozygous ALPL mutations

本研究报道了中国婴儿低磷酸酯酶症(HPP)患者中ALPL基因的新型复合杂合突变c.997+1G>T和c.1405C>T(p.His469Tyr)，通过全外显子测序(WES)和同源建模分析，证实了这两个突变通过影响组织非特异性碱性磷酸酶(TNSALP)的催化功能导致严重婴儿型HPP，为罕见遗传病的分子诊断和遗传咨询提供了重要依据。

　　

在遗传性骨病研究领域，低磷酸酯酶症(Hypophosphatasia, HPP)作为一种罕见的遗传性代谢性疾病，长期以来困扰着临床医生和研究人员。这种疾病由于ALPL基因突变导致组织非特异性碱性磷酸酶(Tissue-Nonspecific Alkaline Phosphatase, TNSALP)功能缺陷，进而引起骨骼矿化障碍。据统计，欧洲人群中严重HPP的患病率约为1/300,000，轻型病例约为1/6,370，但在中国人群中的相关研究数据相对有限。更为棘手的是，HPP的临床表现具有高度异质性，从致命的围产期型到仅表现为牙齿异常的轻型，这种多样性使得准确诊断面临巨大挑战。

婴儿型HPP是其中最为严重的类型之一，患者常在出生后6个月内出现症状，包括骨骼畸形、呼吸困难和反复感染，死亡率高达50%。然而，由于该病临床表现与其他骨骼发育异常疾病存在重叠，如成骨不全症或原发性纤毛运动障碍，往往导致误诊或延迟诊断，错失最佳治疗时机。此外，ALPL基因突变谱存在种族差异，但目前对中国人群中HPP相关突变的认识仍不全面，特别是对新型突变的致病机制研究更为缺乏。

正是在这样的背景下，Li等人针对一例中国婴儿HPP患者展开了深入研究。该患者为4个月16天的男婴，因间歇性呕吐2个月、咳嗽伴发热1周就诊。患儿有反复呼吸道感染史，混合喂养，至今不能抬头。实验室检查显示血钙波动于2.62-3.67mmol/L，血磷1.03-1.7mmol/L，碱性磷酸酶(ALP)显著降低至17.4U/L，同时伴有甲状旁腺激素水平低下。影像学检查发现双手腕、双侧股骨和胫腓骨骨矿物质密度降低，骨小梁稀疏，尺桡骨远端、股骨和胫腓骨干骺端扩大呈杯状或刷状外观，部分骨化中心延迟。

为了明确诊断，研究人员采用了三重全外显子测序(Trio-based Whole-Exome Sequencing)技术，对先证者及其父母的外周血样本进行基因分析。这种方法不仅能够针对ALPL基因进行检测，还能同时排除其他可能引起相似表型的遗传性疾病，在资源有限的环境下具有较高的成本效益。致病性分析遵循美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)2015年发布的序列变异解读指南。

研究团队通过基因分析发现了ALPL基因中的两个新型复合杂合突变。母源遗传的c.997+1G>T为剪接位点突变，位于内含子9的经典GT供体位点，被ACMG标准判定为致病性(PVS1+PM2+PP4)。父源遗传的c.1405C>T(p.His469Tyr)为错义突变，最初被归类为意义不明确变异(Variant of Uncertain Significance, VUS)，但通过进一步分析被重新判定为致病性。

为了深入理解p.His469Tyr突变的功能影响，研究人员利用同源建模(Swiss-Model)分析了该突变对TNSALP蛋白结构的影响。野生型His469为带正电荷的极性残基，不与相邻残基形成极性键。而突变为酪氨酸(不带电荷的极性残基)后，在Tyr469的羟基和Asn47之间引入了一个新的氢键(3.5?)，改变了局部电荷分布和分子内相互作用。这些变化预计会 destabilize 蛋白折叠并损害催化功能，与功能丧失机制一致。

突变鉴定与表征

全外显子测序在先证者ALPL基因中鉴定出两个独特的复合杂合突变。母源遗传的c.997+1G>T剪接位点变异(chr1:21900293; NM_000478.6, 内含子9)根据ACMG标准被归类为致病性。父源遗传的c.1405C>T(p.His469Tyr)错义变异(chr1:21903971; NM_000478.6, 外显子12)最初被指定为意义不明确，但通过生物信息学预测和功能分析被重新分类为致病性。

遗传分离分析

母亲仅对c.997+1G>T为杂合，父亲仅对c.1405C>T为杂合，先证者对两种突变均为复合杂合，通过分离分析确认了常染色体隐性遗传模式。

结构生物学分析

同源建模比较了野生型和突变型在469位残基的结构。野生型His469(带正电荷的极性残基)不与相邻残基形成极性键。突变为酪氨酸(不带电荷的极性残基)后，在Tyr469羟基和Asn47之间引入了新颖的氢键(3.5?，黄色虚线)，改变了局部电荷分布和分子内相互作用。

功能影响机制

c.997+1G>T剪接位点变异破坏了内含子9中的经典GT供体位点，预计会导致外显子跳跃或内含子保留。p.His469Tyr变异通过将带正电荷的组氨酸(469位)替换为不带电荷的酪氨酸，改变了保守催化域中的静电势。Tyr469和Asn47之间的新颖氢键扭曲了活性位点结构，损害了底物结合，将469位确立为功能热点。

本研究报道了ALPL基因的新型复合杂合变异(c.997+1G>T和c.1405C>T/p.His469Tyr)导致中国患者严重婴儿型低磷酸酯酶症的病例。c.997+1G>T剪接位点变异通过破坏经典剪接位点导致TNSALP功能丧失，而p.His469Tyr错义变异通过改变活性位点结构和电荷分布损害酶功能。先证者无法检测到的ALP水平(17.4 U/L)为这些计算预测提供了体内验证。

这一案例强化了双等位基因功能丧失变异驱动严重婴儿型HPP的范式。先证者的复合杂合性，结合了一个截短剪接变异(c.997+1G>T)和一个去稳定错义变化(p.His469Tyr)，导致了残余TNSALP活性。未治疗婴儿型HPP的50%死亡率风险进一步强调了早期基因诊断的紧迫性，特别是在不可逆骨骼损伤发生前的酶替代治疗窗口期。

研究人员选择进行三重全外显子测序而非靶向ALPL筛查，是为了排除具有重叠表型的疾病，如成骨不全症或原发性纤毛运动障碍。这种无偏倚的方法在资源有限的环境中特别具有成本效益。研究结果拓宽了ALPL的突变谱，强调了功能验证在重新分类意义不明确变异中的重要性，增强了对中国人群婴儿型HPP基因型-表型关系的理解，为改善资源有限环境中的分子诊断和遗传咨询提供了重要数据。