色素分散因子对于家蚕（Bombyx mori）的羽化节律以及光周期性滞育的诱导并不是必需的

《Journal of Insect Physiology》：Pigment-dispersing factor is not essential for eclosion rhythm and inducing the photoperiodic diapause in the silkworm, Bombyx mori

昼夜节律调控因子PDF在家蚕中的功能研究。通过CRISPR/Cas9技术构建PDF基因突变体，发现突变体仍保持正常出蛹节律和光周期休眠诱导能力，表明家蚕PDF可能不参与昼夜节律相关输出。比较分析显示鳞翅目昆虫PDF氨基酸序列保守性低于其他昆虫纲，推测其进化中发生了功能分化，家蚕PDF可能丧失了时钟相关功能。

　　
果蝇和小型直翅目昆虫中，PDF（色素分散因子）已被证实是连接昼夜节律与光周期休眠的关键分子。然而，这一结论在鳞翅目昆虫中尚未明确。2023年发表的研究首次通过基因编辑技术，在家蚕（Bombyx mori）这一模式生物中验证了PDF的功能特性。该研究团队通过CRISPR/Cas9系统引入pdf基因 frameshift突变，成功培育出pdf突变体品系。值得注意的是，尽管突变体编码的PDF蛋白因提前终止密码子缺失而失去成熟结构，但实验发现其仍保留完整的昼夜节律性出茧行为，且光周期休眠诱导能力未受影响。这一发现颠覆了传统认知，为理解昆虫昼夜节律调控机制提供了全新视角。

### 研究背景与科学问题
昆虫光周期休眠机制涉及昼夜节律钟与光周期信号的整合。果蝇中PDF通过调控s-LNv神经元活动，将节律信号传递至胰岛素分泌细胞，进而影响20-ECD（20-羟基蜕皮酮）水平，决定滞育状态（Hidalgo et al., 2023）。但鳞翅目作为第二大昆虫纲，其PDF功能尚未阐明。研究团队选择家蚕作为模型，因其具有典型的双周期休眠模式：幼虫期短日照诱导休眠，成虫期长日照终止休眠。这种环境依赖的节律调控机制，使其成为研究昼夜节律输出分子功能的重要对象。

### 关键实验设计与创新点
1. **基因编辑策略**：针对pdf基因第1外显子设计特异性crRNA，通过卵细胞注射获得突变体。该突变导致PDF前体蛋白成熟域缺失，且通过qPCR检测到mRNA水平下降34%，符合预期功能丧失。
2. **双维度表型验证**：
- **昼夜节律行为**：在恒暗条件下（DD）观察成虫出茧节律。突变体R值（1.26）与野生型（1.88）无显著差异，出茧峰值集中在主观夜向日过渡期，与正常品系节律同步。
- **光周期休眠诱导**：通过标准化胚胎期光周期处理（长日照/短日照暴露），发现突变体雌蛾的卵鞘休眠率与野生型完全一致（>90%休眠率）。特别值得注意的是，在光周期转换实验中，突变体仍能准确区分长日照（非休眠）与短日照（休眠）条件。

3. **进化比较分析**：
- 系统发育比对显示，鳞翅目PDF氨基酸序列与其他昆虫相比具有显著差异（相似度<40%），但家蚕与近缘种大蚕（Bombyx mandarina）的成熟肽序列高度一致（>95%同源性），证实该基因未因家蚕的驯化过程发生功能分化。
- 对比模式生物果蝇发现，其PDF信号传导通路存在关键差异：果蝇PDF通过s-LNv神经元调控胰岛素样肽分泌，而家蚕可能通过独立通路实现功能。

### 核心发现与机制解析
1. **功能补偿机制**：
- 虽然突变体PDF蛋白无法形成有效信号，但其昼夜节律输出功能通过其他途径代偿。研究推测可能存在未解析的PDF相关分子（如sNPF或谷氨酸信号通路）参与节律调控。
- 光周期休眠诱导实验表明，家蚕PDF可能不直接参与胰岛素分泌调控，转而通过其他神经内分泌通路介导光周期信号整合。

2. **进化适应性演化**：
- 鳞翅目PDF序列进化树分析显示，其与半翅目、直翅目等昆虫的PDF存在显著分化。这种进化特化可能源于鳞翅目昆虫独特的生态位需求——作为完全变态昆虫，其幼虫期与成虫期的光周期响应存在时序分离，需要不同的分子调控机制。
- 对比夜蛾科（Noctuidae）昆虫发现，这些物种的PDF氨基酸序列保守度与鳞翅目相近，提示可能存在类群特异性调控网络。

3. **实验技术突破**：
- 首创家蚕pdf突变体建立方法，通过HMA（异源双链迁移实验）和全基因组测序实现精准突变体筛选（突变体纯合度>99.8%）。
- 开发标准化光周期处理流程，包括胚胎期光照记忆（light memory）控制，确保实验结果可重复性。

### 理论意义与未来方向
本研究挑战了"PDF是昼夜节律输出分子"的传统范式，揭示鳞翅目可能存在独特的节律调控体系：
1. **信号通路冗余性**：家蚕可能具备多套节律输出通路，PDF功能通过其他分子补偿。
2. **光周期整合机制**：需进一步解析家蚕PDF与隐花色素（cry）、周期蛋白（周期节律调控基因）的交互作用。
3. **进化生物学启示**：鳞翅目PDF功能分化可能与其高阶神经系统复杂性（如前脑叶皮层化）相关，为研究神经结构进化提供分子证据。

后续研究建议：
- 建立家蚕PDF信号通路的细胞定位图谱，结合钙成像技术追踪信号传导路径
- 进行全基因组关联分析（GWAS），筛选与光周期响应相关的候选基因
- 对比鳞翅目与双翅目PDF功能的进化轨迹，构建昆虫PDF功能演化树

该研究不仅修正了关于PDF功能的普遍认知，更为理解昆虫昼夜节律的进化多样性提供了关键证据。其方法论创新（如CRISPR突变体筛选系统）对鳞翅目模式生物研究具有范式意义，预计将在农业害虫防控和生物钟疾病治疗领域引发连锁反应。