miR-124靶向序列调控Ascl1SA6介导的星形胶质细胞在体转分化为神经元和少突胶质细胞的双向命运轨迹

《Communications Biology》：MicroRNA-mediated neuronal detargeting alters astrocyte cell fate conversion trajectories in vivo

本研究针对AAV-GFAP载体在神经元转分化中存在的神经元脱靶表达问题，通过在Ascl1SA6转录单元3'UTR引入miR-124靶序列(124T)，有效抑制了内源性神经元的转基因表达。单细胞转录组分析发现Ascl1SA6驱动星形胶质细胞快速向GABA能中间神经元样细胞转化，而124T延迟转分化进程并引导细胞命运向谷氨酸能神经元和少突胶质细胞样细胞双轨分化。该研究建立了精准转分化技术平台，为神经退行性疾病细胞替代治疗提供新策略。

　　

随着全球人口老龄化加剧，阿尔茨海默病、帕金森病等年龄相关性神经退行性疾病的负担日益加重。这些疾病的共同特征是特定类型神经元的进行性丢失或功能障碍，导致运动、语言和认知等关键日常功能受损。由于成年哺乳动物大脑中死亡神经元极少被替换，开发有效的神经元替代策略成为紧迫的临床挑战。直接神经元重编程技术通过谱系转换转录因子将体细胞（如星形胶质细胞）转化为神经元，为神经修复提供了新希望。

然而，该领域面临着一个关键技术瓶颈：用于驱动星形胶质细胞特异性表达的GFAP微型启动子在AAV载体中会出现神经元脱靶表达，导致难以确认新生神经元的胶质细胞起源。此外，如何精确控制转分化神经元的递质身份以匹配受损环路的需求，也是实现治疗应用的关键科学问题。

在这项发表于《Communications Biology》的研究中，Hussein Ghazale等研究人员开发了一种新型基因递送平台，通过整合microRNA-124靶序列解决了神经元脱靶问题，并意外发现了转录因子Ascl1^SA6调控星形胶质细胞命运转换的新机制。

研究人员采用单细胞RNA测序(scRNA-seq)、谱系追踪和伪时间轨迹分析等技术，在Slc1a3-CreERT;Rosa-zsGreen和Aldh1l1-CreERT2转基因小鼠模型中探究了Ascl1^SA6介导的星形胶质细胞转分化过程。通过将四拷贝miR-124靶序列(124T)插入AAV5-GFAP-Ascl1^SA6载体的3'非翻译区，评估了其对神经元脱靶表达的抑制效果。研究还利用SeeSawPred算法预测了调控命运双轨分化的关键转录因子。

星形胶质细胞预标记证实Ascl1^SA6的转分化能力

通过Slc1a3-CreERT和Aldh1l1-CreERT2系统对星形胶质细胞进行预标记，研究人员证实了Ascl1^SA6能够将成年小鼠运动皮层的星形胶质细胞转化为表达DCX和NEUN的神经元样细胞。在Ascl1^SA6处理组中，63.9%的转导细胞表达未成熟神经元标志物DCX，46.3%表达成熟神经元标志物NEUN，而星形胶质细胞标志物GFAP的表达显著下降至17.8%。

124T序列有效抑制神经元脱靶表达

将124T序列插入Ascl1^SA6载体的3'UTR后，内源性神经元中的转基因表达被有效抑制。与反向序列对照(Ascl1^SA6-mCh-124T-R)相比，正确取向的124T构建体(Ascl1^SA6-mCh-124T)在转导细胞中诱导的DCX和NEUN表达显著降低，表明miR-124介导的转录后调控能够提高AAV-GFAP载体的细胞特异性。

单细胞转录组揭示转分化轨迹异质性

scRNA-seq分析识别出17个细胞簇，包括星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元等主要脑细胞类型。值得注意的是，簇3星形胶质细胞表现出更高的转分化潜能，其特征是S期和G2/M期细胞比例增加以及GSK3靶基因表达降低。伪时间轨迹分析显示，Ascl1^SA6驱动快速的神经元转化，而Ascl1^SA6-124T则延迟命运获得并引导细胞向双轨分化。

124T改变转分化细胞递质身份

基因表达分析表明，Ascl1^SA6优先诱导GABA能中间神经元相关基因(Sp8、Npy、Pvalb)表达，而Ascl1^SA6-124T则偏向激活谷氨酸能神经元标志物(Grik2、Nlgn1、Nrxn1)。免疫荧光验证显示，Ascl1^SA6强烈诱导NPY表达，而Ascl1^SA6-124T偏好激活NLGN1，证实了124T对神经元递质身份的调控作用。

命运双轨分化的转录调控机制

SeeSawPred分析发现，Foxo1在神经元样细胞中富集，而Stat1和Nr3c1在少突胶质细胞样群体中优先表达。这一发现揭示了124T诱导命运双轨分化的潜在转录调控网络，表明细胞外信号可能通过调控这些关键转录因子影响转分化结局。

本研究确立了Ascl1^SA6作为星形胶质细胞向神经元转分化的强效诱导因子，同时证明124T序列不仅能有效抑制神经元脱靶表达，还能重构转分化轨迹，引导细胞向谷氨酸能神经元和少突胶质细胞双轨分化。这一发现对神经退行性疾病的治疗具有重要意义：同时生成神经元和少突胶质细胞的能力，有望在神经元丢失和脱髓鞘并存的疾病（如多发性硬化、脑卒中）中实现更全面的神经修复。该研究建立的精准转分化平台为特定神经细胞类型的原位再生提供了新思路，也为理解转录因子剂量效应和microRNA调控在细胞命运决定中的作用提供了新见解。