多纳米抗体结合SOD1不同表位的结构机制解析及其在肌萎缩侧索硬化症治疗中的潜力

《Communications Biology》：Structural mechanisms and insights on multiple nanobodies binding diverse SOD1 epitopes

本研究针对肌萎缩侧索硬化症(ALS)致病蛋白SOD1的靶向治疗难题，通过解析三种纳米抗体(Nb1、Nb2、Nb3)与SOD1复合物的高分辨率晶体结构，首次揭示了它们结合不同表位的分子机制。研究发现这些纳米抗体能同时结合SOD1且无空间位阻，工程化多聚体纳米抗体亲和力达到4.39 nM，显著增强了SOD1酶活性并抑制纤维形成，为开发ALS新型治疗策略提供了重要结构基础。

　　

在神经退行性疾病研究领域，肌萎缩侧索硬化症(ALS)作为一种致命的运动神经元疾病，一直困扰着医学界。自1993年科学家发现铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)基因突变与家族性ALS相关以来，该蛋白已成为ALS治疗研究的重要靶点。SOD1作为一种关键的细胞内抗氧化酶，负责清除超氧阴离子自由基，维持氧化还原平衡。然而，当SOD1发生突变或错误折叠时，它会形成有毒聚集体，导致运动神经元变性死亡。

目前针对SOD1的治疗策略面临诸多挑战。反义寡核苷酸、RNA干扰和CRISPR/Cas9等技术虽然显示出潜力，但存在免疫原性副作用、脱靶效应和生物安全性问题。小分子药物、多肽和单克隆抗体则受限于低特异性和组织渗透性差等问题。面对这些困境，科学家将目光投向了纳米抗体这一新兴治疗工具。

纳米抗体是源自骆驼科动物重链抗体的可变区片段，分子量仅为传统抗体的十分之一，具有优异的溶解性、稳定性和组织穿透能力。尽管已有专利报道了14种靶向SOD1的纳米抗体，但它们与SOD1相互作用的分子机制尚不明确，这限制了其治疗应用的优化和开发。

在这项发表于《Communications Biology》的研究中，研究人员选择了三种能够抑制SOD1纤维形成的代表性纳米抗体(Nb1、Nb2和Nb3)，通过多种先进技术手段揭示了它们与SOD1相互作用的精细分子机制。

研究人员主要运用了以下关键技术：蛋白质结晶与X射线衍射解析复合物三维结构、等温滴定量热法(ITC)测定结合亲和力与热力学参数、荧光检测尺寸排阻色谱(FSEC)验证生理条件下的结合特性、动态光散射(DLS)分析复合物溶液行为、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)确认分子量，以及酶活性测定和硫黄素T荧光实验评估功能影响。

表征SOD1和三种SOD1特异性纳米抗体

研究人员通过全基因合成获得三种纳米抗体，在大肠杆菌中表达并纯化。MALDI-TOF质谱分析证实了重组蛋白的正确分子量，尺寸排阻色谱成功分离出SOD1-纳米抗体复合物，为后续结构研究奠定基础。

SOD1-纳米抗体复合物的整体晶体结构

研究成功解析了SOD1与三种纳米抗体复合物的高分辨率晶体结构：SOD1-Nb1(2.13?)、SOD1-Nb2(2.74?)和SOD1-Nb3(2.30?)。结构分析显示，三种纳米抗体通过其互补决定区(CDRs)与SOD1的不同表位结合，且均不干扰SOD1的二聚体界面。Nb1结合于SOD1的α-螺旋(VII环)和β-桶的相对侧，Nb2结合于第三和第四β-片层形成的侧面，Nb3则结合于第四β-片层的C端附近。

三种纳米抗体与SOD1结合位点的细节分析

通过精细的相互作用分析发现，Nb1主要依靠CDR2区的氢键与SOD1结合；Nb2的结合亲和力主要由CDR2区的氢键和CDR1区的疏水相互作用贡献；而Nb3则主要通过CDR3区与SOD1形成氢键和盐桥。这些不同的结合模式解释了它们各异的结合特性。

三种纳米抗体与SOD1结合的验证和热力学分析

FSEC实验证实了生理条件下纳米抗体与SOD1的稳定结合。ITC测定显示Nb2和Nb3对SOD1具有纳摩尔级高亲和力(KD值分别为23.2 nM和48.9 nM)，而Nb1亲和力较弱(529 nM)。有趣的是，当纳米抗体组合使用时，观察到明显的变构效应，表明一种纳米抗体的结合会影响其他纳米抗体的结合亲和力。

SOD1及其纳米抗体复合物的酶活性评估

令人惊喜的是，纳米抗体结合不仅没有抑制SOD1活性，反而增强了其酶活性。结构分析发现，纳米抗体（特别是Nb1）通过优化Asp124与金属结合组氨酸(His46/His71)之间的氢键网络，稳定了金属结合位点，从而提高了酶活性。

纳米抗体对SOD1纤维形成的抑制作用

硫黄素T荧光实验表明，纳米抗体能有效抑制SOD1纤维形成。单独使用时，Nb1和Nb3抑制效果达70%，而Nb2为30%。当三种纳米抗体联合使用时，抑制效果协同增强至90%，证明它们能同时结合SOD1且无空间位阻。

靶向SOD1的多聚体串联纳米抗体的设计和验证

基于结构信息，研究人员设计了多聚体串联纳米抗体（如Nb1-Nb2-Nb3），其亲和力进一步提高至4.39 nM，显示出优异的结合特性。

本研究通过高分辨率结构生物学方法，首次揭示了多种纳米抗体同时靶向SOD1不同表位的分子机制。研究发现这些纳米抗体不仅能同时结合SOD1而不产生空间位阻，还能通过变构效应相互影响结合亲和力，甚至增强SOD1的酶活性。工程化的多聚体纳米抗体展现出更高的亲和力，为开发ALS治疗新策略提供了重要理论基础。

该研究的创新性在于全面解析了纳米抗体与SOD1的相互作用网络，证明了多表位靶向的可行性，并展示了纳米抗体在稳定SOD1天然构象、抑制病理纤维形成方面的潜力。这些发现不仅为ALS治疗提供了新思路，也为开发基于纳米抗体的神经退行性疾病治疗策略奠定了坚实基础。随着进一步优化和临床前研究，这些特异性纳米抗体有望成为ALS治疗的有力工具，为患者带来新的希望。