甲基汞暴露诱导大鼠中枢神经系统细胞转录组变化的机制研究：从GP1-APs合成障碍到MAPK信号通路紊乱

《Discover Toxicology》：Effects of methylmercury exposure on the transcriptomes of cell lines from the rat central nervous system

本研究针对甲基汞(MeHg)神经毒性机制不清的问题，通过转录组学分析大鼠神经元(B103)和胶质(C6)细胞系在非致死浓度MeHg暴露下的基因表达变化。发现低浓度MeHg影响神经元GPI-APs合成和3β-HSD活性，高浓度则破坏离子转运；胶质细胞中Rho-GTPase和Na+/K+-ATPase活性受损。microRNA分析显示mmu-miR-466家族通过MAPK通路介导毒性反应。该研究为阐明MeHg神经毒性分子机制提供了新视角。

　　

汞作为一种有毒化学污染物，在自然界和人类活动中广泛存在。其中甲基汞(MeHg)作为汞的有机形态，被认为是毒性最强的形态，主要通过污染鱼类和海鲜进入人体。甲基汞暴露与多种神经系统疾病密切相关，包括小脑性共济失调、构音障碍、脑瘫、震颤、记忆丧失和认知功能受损等。尽管神经系统是甲基汞的主要靶点，但其具体毒性机制尚未完全阐明。

为揭示甲基汞神经毒性的分子机制，Bonfim等研究人员在《Discover Toxicology》上发表了最新研究成果。该研究通过转录组学方法，系统分析了大鼠神经元细胞系(B103)和胶质细胞系(C6)在非致死浓度甲基汞暴露下的基因表达变化，为理解甲基汞对中枢神经系统的毒性作用提供了新的分子视角。

研究采用的主要技术方法包括：细胞培养与甲基汞处理（使用B103和C6细胞系，基于LC₅₀值设置不同暴露浓度）、RNA提取与质量检测（使用SV Total RNA Isolation System，仅RIN>7的样本用于后续分析）、转录组微阵列分析（采用Agilent 4x44K v2基因表达芯片）和生物信息学分析（使用GeneSpring GX 14.5软件进行数据标准化和差异表达基因筛选）。通过基因本体论(GO)分析、通路富集分析和microRNA靶向预测等方法，系统阐明了甲基汞暴露引起的分子变化。

3.1 B103细胞在MeHg暴露后的差异基因表达数据总结

研究人员对B103细胞进行转录组分析后发现，0.1μM MeHg暴露组与对照组相比有798个差异表达基因(DEGs)，其中644个基因上调，154个基因下调。值得注意的是，七个基因的表达变化超过三倍，包括Dcx、4930449C09Rik、Gm30871等。而在2.8μM高浓度暴露组，DEGs数量减少至572个，仅有五个基因表达变化超过三倍。这种低浓度下DEGs数量反而更多的现象可能与hormesis效应有关，即细胞在低剂量暴露时激活多种信号通路维持稳态，而在高剂量时转录机制受到抑制。

特别值得关注的是，两个浓度组之间存在五个重叠的DEGs（Gm14169、Trim14、Gm30871、Dcx和Otoa），这些基因在糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPI-APs)合成中发挥关键作用。GPI-APs对膜组织、信号转导、细胞粘附等重要细胞过程至关重要，该发现为甲基汞神经毒性机制研究提供了新方向。

3.2 B103细胞MeHg暴露后DEGs的功能注释

功能注释分析显示，低浓度MeHg(0.1μM)显著影响类固醇脱氢酶活性[特别是3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)]和信号转导过程。3β-HSD在大脑中的新生合成对神经发育和神经保护至关重要，它催化孕烯醇酮向孕酮的转化，进而产生各种神经类固醇。虽然目前关于甲基汞对大脑中3β-HSD影响的直接证据较少，但甲基汞引起的线粒体功能障碍可能通过影响类固醇生成早期步骤，间接影响3β-HSD的表达和活性。

此外，基因本体分析显示5-羟色胺受体通路也参与其中。越来越多的证据表明甲基汞能够积累在大脑中并破坏神经递质调节，包括多巴胺、谷氨酸和5-羟色胺。甲基汞可能通过增加钙内流损害5-羟色胺受体活性，这种效应可能与AMPA受体功能障碍产生协同毒性。

高浓度MeHg(2.8μM)暴露下，大多数DEGs在转运蛋白活性方面富集，特别是金属离子转运。除了这些富集的GO类别，DEGs还在"离子通道复合物"、"神经发生"和"神经系统发育"等术语中过度表征。这些结果表明甲基汞对神经系统的毒性作用可能归因于转运蛋白活性的破坏，导致金属离子在细胞中积累，引起氧化应激和细胞损伤。

通路富集分析进一步支持了上述发现，显著比例的DEGs在"小分子转运"、"SLC介导的跨膜转运"、"金属离子转运"和"信号转导"等方面富集。溶质载体蛋白(SLCs)对多种物质跨生物膜转运至关重要，特别是在血脑屏障(BBB)中，SLCs作为哨兵保护大脑免受有害物质侵害。该研究为理解甲基汞对大脑稳态的破坏机制提供了重要线索。

3.3 B103细胞DEGs潜在microRNAs的计算机分析

通过miRTarBase预测，研究人员发现0.1μM MeHg处理中有23个miRNA靶向162个基因，而2.8μM处理中有14个miRNA参与97个基因的调控。进一步分析显示，两个处理中的大多数miRNA都靶向参与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的基因。

MAPK信号通路包括p38、细胞外信号调节激酶(ERK)和c-Jun N-末端激酶(JNK)亚家族，调节细胞对应激、增殖和凋亡的反应。甲基汞劫持MAPK信号通路促进氧化应激、炎症和细胞死亡，这一现象在多种组织中得到证实。在桡足类和轮虫中，甲基汞抑制抗氧化防御，同时增加活性氧(ROS)，激活p38和JNK。这种氧化环境增强了NF-κB介导的炎症反应，在小鼠肝脏中，MAPK和NLRP3协同驱动IL-18和IL-1β的产生。

有趣的是，在低甲基汞水平(0.1μM)下，研究人员观察到来自mmu-miR-466家族的miRNA簇参与调控十余个信号通路，包括不饱和脂肪酸生物合成、GABA能突触和钙信号通路。这一发现为研究甲基汞诱导的神经毒性机制开辟了新途径。

3.4 C6细胞在MeHg暴露后的差异基因表达数据总结

对胶质细胞系转录本的分析显示，0.1μM MeHg暴露产生812个DEGs，其中200个上调，612个下调。值得注意的是，十个基因的表达变化超过三倍。相比之下，6.3μM MeHg暴露导致872个DEGs，其中三个基因的表达增加超过三倍。特别值得关注的是，Rps4l、Lamb3和Gm41386在两个MeHg暴露中持续过表达。

Rps4l(核糖体蛋白S4样)基因编码的核糖体蛋白对翻译至关重要，通常对内质网应激作出反应。甲基汞诱导的氧化损伤可以激活这一通路，这一发现与鱼类研究中甲基汞暴露改变核糖体基因表达的结果一致。

Lamb3(层粘连蛋白β3亚基)是负责基底膜完整性的层粘连蛋白亚基，可能受到甲基汞破坏细胞粘附和血管通透性的影响。在人类脑周细胞中，甲基汞激活EGFR-p38 MAPK通路，导致血管内皮生长因子A(VEGF-A)上调并损害血脑屏障功能。VEGF驱动的血管生成和细胞外基质重塑与层粘连蛋白表达密切相关。

Gm41386(预测基因41386)是一个特征不清的基因，可能编码长链非编码RNA(lncRNA)，可能参与表观遗传或转录后调控。甲基汞的表观遗传效应已有充分记载，在LUHMES细胞中，它降低了组蛋白H3乙酰化(H3ac)，并增加了突触基因处的H3K27三甲基化(H3K27me3)。这种染色质重塑可能也延伸至Gm41386，特别是如果它调节神经元分化或应激反应的话。

3.5 C6细胞MeHg暴露后DEGs的功能注释

基于GO富集分析，0.1μM MeHg暴露下最常见的分子功能是蛋白结合、离子结合和小GTP酶结合。Reactome通路富集分析显示，这些DEGs大多数注释到Rho-GTPase信号通路，与先前报道一致。

在高浓度MeHg(6.3μM)下，许多DEGs在广泛类别中显示富集，如蛋白结合。通过全面分析发现，这些基因富集调控ATP酶活性，特别是钠钾交换ATP酶(Na⁺/K⁺-ATPase)。该ATP酶的破坏对细胞产生深远影响，特别是对神经系统。有令人信服的证据表明，即使是低剂量的甲基汞，长期暴露也会导致Na⁺/K⁺-ATPase的下调，这与氧化应激增加有关。由此产生的Na⁺/K⁺-ATPase功能障碍会扰乱神经元能量代谢，损害神经递质摄取（多巴胺和谷氨酸），并可能诱导致畸作用。

扩展这些发现，Reactome通路分析显示高浓度MeHg(6.3μM)显著破坏细胞代谢，损害信号转导，改变离子通道功能，并干扰谷胱甘肽介导的解毒过程。这些发现与已知的甲基汞神经毒性机制一致。

3.6 C6细胞DEGs潜在microRNAs的计算机分析

基于miRTarBase预测，发现23个miRNA在0.1μM MeHg处理中调控314个基因，而24个miRNA在6.3μM处理中调控337个基因。值得注意的是，在低浓度甲基汞暴露(0.1μM)下，14个miRNA主要靶向与MAPK信号通路相关的基因(100个基因)，这与B103细胞系在相同处理下的观察结果一致。

相反，在较高浓度(6.3μM)下，许多miRNA(15个)靶向磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-AKT信号通路(136个基因)，其次是MAPK信号通路(117个基因)。甲基汞与PI3K/AKT信号通路相互作用的一个有趣方面是其双重作用，根据背景和浓度的不同，要么促进细胞存活，要么导致细胞死亡。在低浓度下，甲基汞诱导的PI3K/AKT通路激活似乎具有保护功能，可能代表细胞在较高浓度触发凋亡机制之前试图对抗毒性。相反，长期或较高浓度甲基汞暴露对PI3K/AKT/mTOR通路的失调似乎会导致细胞死亡和功能障碍。

在发育中的大脑中，PI3K/AKT/mTOR通路对神经元生长、存活和可塑性至关重要。在大鼠模型中，产前暴露于甲基汞会导致30天龄大鼠幼崽海马中PI3K/AKT/mTOR信号通路的下调。这种下调与tau蛋白在Ser396位点的过度磷酸化有关，后者可能破坏微管稳定性并导致神经元功能障碍。此外，该通路的破坏与行为缺陷相关，包括焦虑样行为增加、探索减少以及短期和长期记忆缺陷。

此外，研究结果揭示了mmu-miR-466家族簇与高浓度甲基汞暴露(6.3μM)下C6细胞中不饱和脂肪酸生物合成调控之间的引人注目联系。这表明甲基汞暴露触发了一个关键的调控反应，由在这些细胞模型中一致的保守miRNA特征驱动。

令人惊讶的是，结果显示mmu-miR-1192、mmu-miR495-3p和mmu-miR-669c-3p在高浓度甲基汞暴露(6.3μM)响应中调控大量信号通路(40条通路)方面发挥核心作用。与这些miRNA最相关的通路是轴突导向。在该通路内，三个miRNA靶向的大多数基因是主要参与WNT信号通路的受体(Ptch1、Fzd3、Bmpr2和Bmpr1b)，该通路调节轴突吸引。

胶质细胞在引导轴突轨迹中的作用值得关注。实验室芯片模型显示，低剂量甲基汞(0.1μM)使单个神经元在L1包被微模式上的轴突转向准确性降低40%，表明甲基汞可能影响星形胶质细胞分泌或表面呈现L1。同时，甲基汞通过RhoA激活诱导星形胶质细胞中肌动蛋白细胞骨架重组，导致突起回缩和接触引导丧失。抑制RhoA/ROCK信号可挽救这些形态变化，突显了胶质细胞形状在指导轴突轨迹中的作用。

研究结论与意义

本研究对神经元和胶质细胞系在非致死甲基汞暴露后的差异基因表达进行全面分析，为理解潜在的分子机制和对细胞过程的潜在影响提供了宝贵见解。

在神经元细胞中，甲基汞暴露导致大量差异表达基因，其中与蛋白激酶结合和糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPI-APs)合成相关的基因表达发生显著变化。功能注释突显了甲基汞在低浓度下改变激素和信号通路的作用。在高浓度下，甲基汞损害转运蛋白活性，导致金属离子积累、氧化应激和细胞损伤。此外，两个浓度下的microRNA调控分析揭示了miRNA(mmu-miR-466家族)与参与MAPK信号通路基因之间的潜在相互作用。

在胶质细胞中，甲基汞暴露主要影响Rho GTPase信号通路。在高浓度甲基汞下，DEGs富集于ATP酶活性，特别是钠钾交换ATP酶(Na⁺/K⁺-ATPase)。胶质细胞中的microRNA分析显示miRNA靶向与MAPK信号通路相关基因的类似调控模式，表明甲基汞在不同细胞类型中破坏共同的分子通路。此外，人类表型本体论(HPO)术语分析揭示了甲基汞暴露与神经系统异常、骨骼肌异常、脑形态异常和高级心理功能异常之间的一致关联，这些关联与细胞系和浓度无关。

总之，该研究为理解中枢神经系统细胞体外暴露于甲基汞相关的复杂分子反应和潜在健康影响提供了重要见解。结果强调了理解甲基汞毒性分子机制的重要性，这对人类健康和环境安全都具有重要意义。该领域的进一步研究对于增进我们对甲基汞影响的理解至关重要。