综述：通过双靶向CAR-T细胞疗法推进乳腺癌治疗

《Hormones & Cancer》：Advancing breast cancer treatment through dual targeting CAR T cell therapy

本综述系统阐述了双靶向嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在克服乳腺癌抗原异质性、免疫逃逸及抑制性肿瘤微环境（TME）等挑战中的最新进展。文章比较了慢病毒、逆转录病毒及转座子等载体平台的设计差异，并深入探讨了双单链抗体（scFv）构建体转导效率降低（65-75% vs 单靶点92-98%）、生产周期延长（18-28天）及成本高昂（50-70万美元/疗程）等关键制造瓶颈。同时，综述还涵盖了细胞因子释放综合征（CRS）、神经毒性等安全性考量，以及串联CAR、双顺反子构建体、逻辑门控SynNotch电路等创新CAR工程策略，为将该疗法从实验开发转化为临床可行、经济可持续的乳腺癌治疗方案提供了全面视角。

　　

引言

乳腺癌是全球女性中最常被诊断出的癌症，其发病率和死亡率在不同国家间存在显著差异。乳腺癌的异质性——分为Luminal A/B、HER2阳性和三阴性亚型——带来了重大的治疗挑战，尤其是对于抵抗常规化疗、内分泌治疗和HER2靶向药物的侵袭性类型。免疫检查点抑制剂（ICIs）通过靶向PD-1/PD-L1信号通路重新激活T细胞功能，已成为一种有前景的策略。然而，在转移性乳腺癌中的临床反应仍然有限（15-20%），且 largely 局限于PD-L1阳性的三阴性乳腺癌（TNBC）。这种有限的成功将注意力转向了CAR-T细胞疗法，该疗法通过在CD19阳性白血病中实现超过90%的缓解率，改变了血液恶性肿瘤的治疗格局。尽管在靶向HER2、MUC1或间皮素的乳腺癌模型中取得了令人鼓舞的临床前结果，但单靶点CAR-T细胞在实体瘤（包括乳腺癌）中表现出最小的临床疗效，客观缓解率低于13%。其主要障碍现已得到广泛认识：抗原异质性和免疫逃逸、免疫抑制性肿瘤微环境（TME）以及毒性和脱靶效应。

CAR-T细胞技术概述

嵌合抗原受体（CAR）T细胞机制的基本结构涉及一组独特的蛋白质结构域组合，能够靶向癌细胞，实现肿瘤特异性识别和T细胞活化。细胞外抗原结合域由一个单链可变片段（scFv）组成，该片段最常作为单克隆抗体的一部分产生，并决定靶点（例如B细胞恶性肿瘤中的CD19）。该scFv随后连接到铰链区，这是一个提供空间灵活性以支持抗原相互作用的间隔区。铰链长度和组成（即CD8α或IgG来源）在结合动力学和免疫突触形成中起关键作用。CAR通过其跨膜结构域（例如CD8α或IgG来源）锚定，以跨越脂质双分子层与细胞内信号组件相互作用。更重要的是，共刺激结构域（例如CD28或4-1BB）与CD3ζ免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM）整合，为T细胞增殖、持久性和细胞因子积累提供协同信号。

CAR的演变反映了这些结构域的迭代优化：第一代仅包含CD3ζ，存在持久性/效应功能有限的问题；第二代引入单一共刺激结构域（CD28或4-1BB），在B细胞恶性肿瘤中增强了存活/疗效；第三代包含双共刺激结构域（例如CD28+4-1BB），放大了信号但也增加了耗竭风险；第四代/第五代是"装甲化"CAR，具有细胞因子分泌（例如IL-12）或可诱导的安全开关。

从单靶向到双靶向CAR-T细胞构建体的演变代表了一种新的过继性细胞疗法开发范式：单靶向治疗方法在血液和实体瘤中的内在治疗局限性已变得明显。尽管它们在治疗CD19⁺恶性肿瘤方面具有革命性意义，但单靶点CAR-T细胞也存在一些挫折，例如抗原逃逸（发生在30-60%的B-ALL患者中）、肿瘤异质性和靶向/脱肿瘤毒性。双靶向方法使用共转导的CARs、串联CARs（TanCAR）或双顺反子构建体，代表了一种协同方法，可以更有效地识别并减少逃逸机制。

双靶向CAR-T细胞的设计原理与工程方法

双靶向CAR-T细胞疗法是一项新技术，旨在通过双信号抗原特异性增强癌症免疫治疗的安全性和有效性，特别是针对像乳腺癌这样的实体瘤，并克服免疫治疗的局限性，包括异质性和抗原逃逸。双靶向CAR-T细胞利用传统CAR-T细胞疗法的概念，通过修饰或设计CAR-T细胞以顺序或同时方式识别两个独立的肿瘤相关抗原。

理想靶点的选择在双靶向CAR-T细胞疗法的功效和安全性中起着重要作用。其理想靶点在肿瘤细胞上高表达，在正常组织上低表达，以减少脱靶效应。例如，科学家们已经研究了如何在肝癌中产生针对细胞内甲胎蛋白（AFP）和细胞表面磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）的双靶向CAR-T细胞。通过利用AFP作为肝癌生物标志物的优异特异性，该策略可以攻击GPC3以更好地识别肿瘤细胞。

双特异性CAR受体架构将两个结合域整合到单个CAR分子中。这种设计允许CAR-T细胞同时结合肿瘤细胞表面的两个不同抗原。存在多种配置，包括串联CAR，其中两个靶向不同抗原的单链可变片段（scFvs）被串联连接。串联CAR也可以靶向同一抗原的不同表位。这种方法增强了CAR-T细胞对肿瘤细胞的亲和力，促进更强的活化和细胞毒性。

在共表达CAR系统中，CARs在同一个CAR-T细胞内独立运作。这可以通过在相同mRNA转录本上编码两个CAR的双顺反子构建体实现，或者通过用两个各自携带不同CAR的载体共转导T细胞实现。当CARs与肿瘤细胞中的相应抗原结合时，只有当两个CAR都结合时，T细胞活性才会被完全刺激。

逻辑门控方法为CAR-T细胞疗法提供了一个更复杂的解决方案，以提高其特异性和安全性：逻辑门控CAR-T细胞的激活需要识别多个抗原。这些设计包含更清晰的布尔逻辑门，包括AND、OR和NOT门，以根据特定抗原的存在或缺失来调节CAR-T细胞的活性。带有AND门的CAR-T细胞明确规定T细胞仅在两种抗原都存在的情况下才被激活，降低了在表达任一靶抗原的健康组织中发生脱靶毒性的风险。采用OR门构建体时，只要任何靶抗原表达，CAR-T细胞就会被激活，提高了靶向肿瘤的特异性并减轻了抗原逃逸。NOT门设计可以在遇到与健康组织相关的特定抗原时抑制CAR-T细胞活性，进一步提高了安全性。

靶向乳腺癌双靶向CAR-T细胞疗法的抗原

双靶向CAR-T细胞疗法是抗击乳腺癌的一种有前景的策略，旨在克服肿瘤异质性和抗原逃逸等挑战。这种创新方法涉及设计T细胞，通过同时靶向两种不同的抗原来识别和攻击癌细胞。

双靶向CAR-T细胞疗法在乳腺癌中的疗效关键取决于靶抗原的合理选择，这是一个由旨在最大化治疗精度同时最小化毒性的相互关联原则层次结构所控制的过程。首先，理想的抗原需要具有高肿瘤特异性和过表达；也就是说，抗原主要表达于甚至局限于肿瘤细胞，而非健康组织，以避免靶向/脱肿瘤毒性。例如，虽然HER2是一个明确的靶点，但其在正常组织（如心肌细胞）中的有限存在仍然是15-30%乳腺癌病例中心脏毒性的风险。靶向癌睾抗原或谱系限制性抗原（在正常体细胞中表达极低）更符合此标准。另一个主要原则涉及要求抗原在所有肿瘤亚克隆中均匀表达以克服抗原逃逸，这是单靶向疗法中复发的主要原因之一。在乳腺癌中，诸如MUC1和CD70等靶点比其他表现出空间异质性的靶点表达更一致，双靶向策略可以通过配对具有非重叠逃逸机制的抗原（如癌基因和结构蛋白）来降低这种风险。

此外，最佳抗原必须具有高免疫原性和抗原性，应能诱导T细胞活化，并且以结构上易于CARs稳定结合的形式存在于细胞表面，而非细胞内或可溶性亚型。抗原对肿瘤生存的关键生物学重要性也至关重要；靶击对增殖或转移重要的蛋白质，如信号节点EGFR或锌转运蛋白LIV-1，降低了肿瘤在治疗压力下下调抗原的可能性。最后，双靶向方法的成功取决于所选抗原对的互补性，应利用正交机制产生协同效应。这可以通过空间互补性实现，即一种抗原广泛表达而另一种具有亚型特异性，或者通过靶向具有不同功能作用或细胞外域脱落率低的抗原以确保持续的CAR接合。通过遵守这些严格的选择标准，双靶向CAR-T细胞疗法可以进行战略性设计，以克服治疗异质性实体瘤（如乳腺癌）的关键挑战。

肿瘤异质性与微环境：双靶向与CAR-T工程策略作为互补解决方案

CAR-T细胞疗法在乳腺癌中的临床成功仍然受到两个相互关联的抵抗机制的限制：肿瘤异质性和免疫抑制性肿瘤微环境（TME）。异质性出现在多个生物学层面——患者间、肿瘤内、空间和 temporal——导致可变抗原表达，并在单靶点治疗后促进免疫逃逸。这种多样性驱动了不同乳腺癌亚型（如Luminal、HER2富集和三阴性）的差异反应，其中抗原丢失变体经常在治疗压力下出现。双靶向CAR-T细胞策略通过扩大抗原覆盖范围、降低克隆逃逸的可能性并增强整体细胞毒性持久性来应对这一挑战。

除了固有的异质性之外，TME对CAR-T细胞的运输、活化和存活施加了巨大的物理、代谢和免疫学限制。乳腺癌微环境富含抑制性细胞因子（TGF-β、IL-10）、髓源性抑制细胞（MDSCs）和癌症相关成纤维细胞（CAFs），它们共同限制免疫浸润并促进耗竭。设计能够分泌细胞因子（如IL-12）或表达显性负性TGF-β受体的"装甲化"CAR-T细胞已在临床前研究中成功逆转这种抑制并恢复效应功能。

因此，将应对抗原多样性的双靶向CAR-T细胞策略与克服TME诱导抑制的工程化CAR构建体相结合，代表了一个互补的、分层的治疗框架。这种综合方法有潜力在乳腺癌中实现更持久、更广泛的肿瘤根除，同时解决肿瘤内在和外在的障碍。

双靶向CAR-T细胞在乳腺癌中的临床前景

双靶向CAR-T细胞疗法在乳腺癌中的临床前景代表了癌症免疫治疗中一个不断发展的前沿领域，临床试验活动显著增长并显示出有希望的早期疗效信号，尽管在实现最佳治疗结果方面仍面临挑战。

在双靶向策略出现之前，已有几种肿瘤相关抗原在三阴性乳腺癌（TNBC）中作为单CAR-T靶点进行探索，其中间皮素（MSLN）受到了广泛关注。MSLN在大多数TNBC肿瘤中选择性过表达，而在正常组织中基本缺失，这使其成为一个安全且肿瘤特异性的靶点。临床前和转化研究表明，MSLN导向的CAR-T细胞在TNBC模型中诱导有效的细胞毒性，并在微环境调节和优化抗原呈递后改善了治疗反应。此外，创新的平台如双特异性或分泌BiTE的MSLN-CAR-T构建体通过接合多个免疫通路，展示了增强的肿瘤根除和减少的抗原逃逸。这些发现突出了MSLN作为关键单靶点模型的转化价值，该模型为旨在克服TNBC中常见的异质性和适应性抵抗的下一代双靶向CAR-T疗法的设计提供了信息。

当前的临床前景包括超过22项评估CAR-T细胞疗法在乳腺癌中作用的活跃临床试验，其中双靶向方法约占全部研究的15-20%。所有乳腺癌CAR-T试验计划入组总人数超过1000名患者，主要试验包括NCT04650451（HER2，n=220）、NCT02414269（间皮素，n=179）和NCT04025216（TnMUC1，n=112）。值得注意的是，NCT04430595试验代表了最大的双靶点研究，靶向HER2/GD2/CD44v6，入组100名患者。目前的双靶向临床试验显示出地理集中性，主要在美国和中国，有限的全球可及性反映了制造和监管的复杂性。大多数试验（85%）处于I期研究阶段，表明该治疗方法处于早期发展阶段。

临床数据显示不同CAR-T细胞方法在乳腺癌中的缓解率各异。HER2靶向CAR-T细胞疗法的总缓解率（ORR）在50-83.3%之间，而MUC1靶向方法的缓解率在60-65%之间。双靶向策略，特别是血液恶性肿瘤中的CD19/CD20 CAR-T细胞，实现了72.7%的缓解率，完全缓解（CR）率为63.6%。对于实体瘤，CAR-T细胞疗法的汇总总缓解率为9%（95% CI: 4-16%），完全缓解率为2.3%，部分缓解（PR）率为9.5%。然而，双靶向方法显示出更高的疗效，在特定乳腺癌亚型中缓解率达到62-72%。EGFR靶向CAR-T细胞在三阴性乳腺癌中表现出强大的抗肿瘤活性，临床前研究显示总缓解率为75%，完全缓解率为40%。MUC1 CAR-T细胞疗法在TNBC中显示出特殊前景，临床试验报告总缓解率为65%，完全缓解率为35%。

挑战与机遇

双靶向CAR-T细胞疗法用于乳腺癌面临着包括复杂载体设计、延长的制造时间线、严格的质量控制、增加的毒性风险以及 formidable 的TME障碍在内的重大挑战，同时也通过先进的工程化、制造创新、联合方案、个性化医疗和监管策略提供了变革性的机遇。

双scFv构建体的制造复杂性显著降低了转导效率（65-75% vs 单靶点92-98%），并且每批次超过200个工时，导致静脉到静脉时间延长至18-28天，并将成本增加至每疗程50-70万美元。实现两个CAR平衡表达的需求、插入突变的风险以及载体选择的复杂性（需要考虑慢病毒、逆转录病毒和基于转座子的系统）也是关注点。临床上，由于双CAR信号传导导致的细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性等安全风险需要复杂的剂量和监测方案；扩大的抗原跨度还带来了靶向/脱肿瘤毒性的安全威胁，需要进行深入的正带组织表征。患者选择仍处于早期阶段，缺乏统一的预测反应或毒性的双抗原生物标志物检测标准。在肿瘤微环境内，CAF和MDSC驱动的TGF-β/IL-10分泌、缺氧诱导的ECM重塑和营养竞争严重限制了CAR-T细胞的浸润、持久性和功能，需要联合方法来破坏免疫抑制网络和物理屏障。

相反，创新路径涉及SynNotch和模块化通用CAR平台，允许逻辑门控或肿瘤诱导的激活；工程化分泌IL-12/15以修饰TME的细菌样CAR-T细胞；以及设计包含负责产生共刺激剂的多个信号结构域的第三代CAR，从而进一步延长CAR-T细胞的持久性和细胞毒性。生产可以通过自动化封闭系统生物反应器、护理点制造和基于AI/ML的质量控制（QC）来简化和降低成本，非病毒递送方法（PiggyBac, mRNA）具有快速扩大生产规模的潜力。

CAR-T细胞制造的最新创新通过采用封闭系统自动化生物反应器平台（如CliniMACS Prodigy和Lonza Cocoon）显著提高了可扩展性、安全性和可负担性，这些平台将手动劳动、污染风险和生产时间减少了高达40%。非病毒基因转移系统（如PiggyBac和Sleeping Beauty）实现了无病毒、可扩展的CAR-T生产，成本仅为慢病毒方法的10-20%，而基于CRISPR-Cas9的同种异体"现货"CAR-T细胞进一步降低了患者特异性成本和制造复杂性。整合AI驱动的分析和机器学习通过预测最佳转导窗口和降低批次失败率改善了过程控制。分散式护理点生产模型，由Cellectis、Poseida展示以及来自印度的真实世界数据，已成功生产出临床级CAR-T疗法，每位患者的成本降低超过50%。

体内CAR工程代表了一种新兴的下一代策略，有望克服体外CAR-T生产的制造和物流瓶颈。体内CAR工程无需自体细胞采集、遗传修饰和回输，而是使用靶向递送平台直接在患者体内编程免疫细胞。根据Li等人（2025年）的研究，当前的体内策略利用纳米颗粒基、病毒和生物指令支架系统将CAR转基因直接递送到T细胞或其他效应免疫亚群，从而简化疗法并消除复杂的制造步骤。纳米颗粒和病毒递送方法尤其允许在肿瘤部位实现局部CAR表达，增强安全性并最小化全身细胞因子毒性。此外，可植入支架可以作为微环境，促进CAR在实体瘤（如TNBC）中的扩增和持久性。这种"现货"体内CAR工程范式有潜力显著降低成本、缩短周转时间，并提高对实体恶性肿瘤患者的可及性。

为了提高可负担性和临床采用率，经济模型（如基于价值的报销和结果关联定价）越来越多地被提议用于可持续的CAR-T疗法实施。将双靶向CAR-T细胞与检查点抑制剂、溶瘤病毒或ECM降解剂配对的联合策略在克服TME抵抗和改善运输方面显示出前景。通过单细胞抗原分析和循环肿瘤DNA（ctDNA）监测的个性化医疗指导适应性双抗原选择，解决时空异质性并减少复发。

最后，监管和商业化创新——适应性试验设计、基于价值的报销、分散式制造网络和协调的全球框架——可以加速批准、扩大可及性并优化成本效益，推动双靶向CAR-T细胞疗法从实验性承诺走向临床现实。

结论

双靶向CAR-T细胞疗法代表了乳腺癌免疫治疗管理的关键演变，提供了一个战略性框架，以克服抗原异质性、免疫逃逸和抑制性TME的内在挑战，这些挑战历史上限制了单抗原方法。通过工程化T细胞，通过串联CARs、双顺反子共表达系统或可编程逻辑门控电路识别两个不同的肿瘤相关抗原，这种下一代策略增强了肿瘤特异性，减轻了抗原逃逸，并微调了效应功能。整合亲和力优化的scFv结构域和选择性共刺激基序（CD28、4-1BB或OX40）允许精确调节激活阈值，提高了在抗原多样性乳腺癌亚型中的疗效和安全性。

载体工程的技术进步，特别是非病毒转座子系统（如PiggyBac和Sleeping Beauty）以及AI/ML驱动的制造管道，正在加速生产同时降低成本，实现了可扩展且患者定制的CAR-T制造。尽管取得了这些进展，双靶向引入了独特的转化复杂性，包括降低的转导效率、载体大小限制以及强直信号诱导耗竭的可能性。临床上，扩大的抗原范围增加了细胞因子释放综合征（CRS）和脱肿瘤反应性的风险，需要整合可调安全机制，如可诱导自杀基因、可切换CARs和基于mRNA的瞬时平台。在肿瘤微环境内，基质和免疫抑制障碍（如CAF和MDSC衍生的TGF-β和IL-10分泌、ECM纤维化、缺氧和代谢竞争）继续损害CAR-T细胞的运输、持久性和功能。克服这些障碍可能需要合理的联合方案，将双靶向CAR-T疗法与检查点抑制剂（PD-1/CTLA-4阻断）、溶瘤病毒、细胞因子调节剂（IL-12/15）或ECM降解酶整合，以重塑TME并维持免疫激活。

双靶向CAR-T细胞疗法的未来轨迹在于合成生物学、计算免疫学和精准肿瘤学的融合。由单细胞蛋白质组学分析和循环肿瘤DNA（ctDNA）监测指导的适应性抗原选择可以实现实时抗原配对和患者特异性治疗优化。新兴的模块化CAR平台，如SynNotch、SUPRA CAR和通用同种异体构建体，提供可编程逻辑和可控激活，在最小化毒性的同时扩展临床适用性。此外，分散式、自动化的生物反应器系统和AI驱动的质量控制正在重新定义制造可扩展性，缩短静脉到静脉时间，并在全球医疗系统中实现民主化访问。为了将双靶向CAR-T细胞疗法从有前景的实验模式转变为临床标准化治疗，必须共同努力解决监管协调、长期安全监测和基于价值的报销框架。学术界、生物技术和监管机构之间的合作倡议对于建立强大的转化管道和公平的分配模式至关重要。生物工程、系统免疫学和监管科学交叉领域的持续创新有望将双靶向CAR-T细胞疗法转变为一种持久、安全且具有成本效益的免疫疗法，能够提供长期缓解并重新定义乳腺癌的治疗标准。