氧化锌纳米颗粒螯合磷酸肌酸接枝壳聚糖复合水凝胶在促进骨再生中的骨形成和血管生成作用

《Frontiers in Medicine》：Zinc oxide nanoparticle chelated phosphocreatine-grafted chitosan composite hydrogels for enhancing osteogenesis and angiogenesis in bone regeneration

本研究开发了一种新型水凝胶CSMP-ZnO，通过ZnO纳米颗粒与磷酸化壳聚糖的协同作用，促进骨再生和血管生成。体外实验显示Zn2+释放显著提高成骨相关基因(RUNX2、BMP2)和蛋白(COL-1、ALP)表达，并增强细胞增殖与迁移能力。体内动物实验证实CSMP-ZnO可加速颅骨缺损修复，形成致密骨组织及血管网络。该水凝胶兼具优异力学性能、抗肿胀性和降解可控性，为骨组织工程提供新策略。

　　
近年来，骨组织工程领域的研究热点集中在开发兼具生物相容性、机械强度和功能调控能力的智能水凝胶材料。本研究创新性地将水溶性磷酸化改性壳聚糖（CSMP）与氧化锌纳米颗粒（ZnO-NPs）通过超分子结合机制复合，构建出具有双重功能调控特性的骨再生水凝胶。该材料通过磷酸基团与ZnO-NPs的螯合作用形成稳定复合结构，同时利用磷酸 creatine（PCr）的缓释特性实现Zn2?的精准释放。实验表明，该复合水凝胶在骨缺损修复中展现出显著的协同效应，其机制涉及力学性能优化、离子缓释调控及多信号通路激活。

**材料设计创新**
研究团队通过化学改性策略，在壳聚糖主链引入甲丙烯酸（MA）和磷酸基团（PCr），构建出CSMP水凝胶。这种分子设计实现了三重功能整合：MA引入的交联位点为后续纳米复合提供反应基团；PCr的双功能特性既作为ZnO-NPs的配位位点，又可作为矿化支架的磷源储备。当ZnO-NPs（粒径50±10 nm）与CSMP溶液混合时，纳米颗粒表面锌离子与磷酸基团通过静电配位形成超分子网络，这一过程通过扫描电子显微镜（SEM）观察到纳米颗粒均匀分散于壳聚糖纤维结构中，形成50-100 μm的仿生孔隙体系。

**性能优化与机制解析**
力学性能测试显示，ZnO-NPs的添加使复合水凝胶的压缩模量提升至120.48±14.24 kPa（5 mg/mL浓度时），较纯CSMP提升5.4倍。这种增强源于纳米颗粒的桥梁效应——ZnO-NPs不仅作为机械支撑点，更通过表面羟基与壳聚糖氨基形成氢键网络，从而提升材料整体致密性。然而当ZnO-NPs浓度达到10 mg/mL时，压缩模量下降至88.14±11.24 kPa，这可能由纳米颗粒团聚导致的应力分散效应引起。

材料降解行为研究显示，ZnO-NPs的引入使水凝胶在磷酸盐缓冲液（PBS）中的降解速率提升15%-20%。这种差异源于纳米颗粒的催化作用：Zn2?激活了壳聚糖分子链中的糖苷键水解，同时ZnO表面缺陷态氧加速多糖链断裂。值得注意的是，复合水凝胶在28天内的质量保持率仍达82%，表明其降解速率与骨组织再生周期（约6-8周）具有良好匹配性。

**生物学效应的多维度验证**
体外实验证实，Zn2?的缓释特性显著增强了成骨细胞（rBMSCs）的分化效率。通过Western blotting检测发现，复合水凝胶促进的骨相关蛋白（COL-1、RUNX2、BMP2）表达量较空白对照提升2.3-3.8倍。特别是COL-1蛋白表达量达到对照组的4.2倍，这与其促进钙磷沉积的生物学功能直接相关。荧光显微分析显示，在CSMP-ZnO（5 mg/mL）处理组，RUNX2蛋白的细胞质定位密度较对照组增加60%，证实了锌离子对成骨转录通路的激活作用。

在血管生成方面，通过Transwell实验发现，复合水凝胶促进的HUVECs迁移效率提升1.6倍。锌离子的释放激活了VEGF和FGF2等促血管生成因子，使管腔形成密度增加35%。值得注意的是，这种血管化效应与骨再生存在时间耦合：在植入后4周，骨缺损边缘已形成功能性毛细血管网，为骨基质沉积提供氧合微环境。

**体内修复效果的关键证据**
动物实验部分采用5 mm直径的颅骨缺损模型，植入CSMP-ZnO（5 mg/mL）后，8周时新骨体积（BV）达对照组的3.2倍，骨小梁密度（Tb.N）提升至对照组的2.8倍。组织学分析显示，复合水凝胶组不仅骨矿化面积占比（BV/TV）达82%，其新生骨组织呈现典型的板层状结构，胶原纤维排列方向与机械载荷方向一致，这可能与纳米颗粒引导的骨改建微环境有关。

**创新机制与临床转化潜力**
研究揭示了锌离子调控骨再生的多通路机制：一方面通过激活BMP2/Smad1信号通路促进成骨分化，另一方面通过调控VEGF介导的血管生成过程改善组织修复效率。特别值得关注的是，ZnO-NPs的缓释特性（28天内释放量达初始值的65%）与骨矿化速率曲线高度吻合，这种时间-空间协同释放模式避免了传统骨修复材料因释放过快导致的骨吸收现象。

该研究在材料设计层面实现了突破：通过超分子复合技术将无机纳米颗粒与有机高分子完美结合，既保留了天然材料的多孔微纳结构，又赋予其可控的离子释放特性。这种"结构-功能"一体化设计为骨再生材料提供了新的技术范式，其临床转化潜力体现在三个方面：①自支撑水凝胶可避免二次手术取出；②可降解特性与骨再生周期匹配；③多信号协同作用可突破单一生长因子局限。

**研究局限与未来方向**
当前研究在以下方面存在局限：首先，未考察纳米颗粒的免疫原性，需通过ELISA检测细胞因子释放谱；其次，动物实验周期较短（8周），未能观测长期骨改建过程中的材料降解与骨吸收的动态平衡。建议后续研究采用基因编辑技术验证锌离子通路的必要性，并建立体外-体内联合评价体系，特别是引入微流控芯片模拟骨修复微环境，以更精准预测材料性能。

该成果为骨再生材料的设计提供了重要启示：未来材料研发应注重"仿生结构-智能响应-微环境调控"的三维协同设计。通过调控纳米颗粒的表面化学特性（如磷酸基团密度）、尺寸分布（50-100 nm范围优化）和浓度梯度（5 mg/mL最佳），有望开发出具有个性化修复能力的智能骨材料，这为解决临床骨缺损修复中的材料失效、免疫排斥等问题开辟了新路径。