从接种HPV疫苗的女性中筛选和鉴定能够中和HPV18病毒颗粒（VLP）的抗体

《Frontiers in Immunology》：Screening and identification of human HPV18VLP neutralizing antibodies from women receiving HPV vaccine

HPV18病毒样颗粒特异性Fab抗体通过噬菌体展示技术构建，经四轮富集筛选获得高亲和力抗体VLP18-Fab，显示剂量依赖性中和活性（P<0.0001），并通过结构模拟预测抗原结合位点，为HPV疫苗设计提供新思路。

　　
该研究聚焦于通过噬菌体展示技术构建HPV18特异性Fab抗体库，并探索其潜在临床应用价值。研究团队从接种HPV疫苗的15名女性志愿者中分离外周血单核细胞，通过RNA反转录和PCR扩增获得重链可变区（VH）、轻链可变区（Vλ/Vκ）及恒定区基因片段。经两次重叠延伸PCR构建完整Fab基因，并与表达载体pComb3XTT连接，最终构建出包含4.91×10^9（Fabλ）和2.92×10^9（Fabκ）克隆的抗体库。

在四轮富集性筛选中，采用递增的洗涤条件（0.05%→0.3% Tween-20）逐步淘汰非特异性结合抗体。通过ELISA检测发现，经四轮筛选后阳性克隆比例显著提升，最终从约40万个克隆中筛选出单一阳性克隆VLP18-Fab。该抗体对HPV18病毒样颗粒（VLP）的结合affinity达到1.002×10^-5 M，结合特异性经Western blot和免疫组化双重验证。

中和活性实验采用293FT细胞转染系统，结果显示VLP18-Fab在1:729稀释度下仍能完全中和HPV18伪病毒（P<0.0001）。结构生物学分析表明，该抗体与HPV18 VLP的相互作用涉及493-948位共12个关键氨基酸残基，其中Asp548、Gln923和Arg947形成深度结合口袋。特别值得注意的是，VLP18-Fab通过识别VLP表面独特的构象表位，而非传统抗原表位，这解释了其广谱中和能力。

技术路线创新体现在三方面：首先采用人源化抗体库（λ/κ链比例接近自然免疫应答），其次开发梯度洗涤方案（pH9.6抗原包被→0.3% PBST洗涤），使富集效率提升百倍；最后结合AlphaFold2预测和Discovery Studio分子对接，建立从抗体筛选到结构解析的完整体系。实验数据显示，四轮筛选后抗体库多样性保持82%以上，且通过生物层干涉仪（BLI）测得KD值与ELISA OD值呈显著正相关（R2=0.93）。

临床转化潜力方面，研究证实该抗体可通过被动免疫机制快速中和病毒（作用时间<30分钟），这与疫苗需数周诱导免疫应答的特点形成互补。特别是对接种后仍存HPV18感染的免疫缺陷人群（如器官移植患者）， Fab18-Fab展现出独特优势——其分子量仅42kDa，穿透细胞膜的能力较传统IgG提升3倍，且通过Fab片段设计规避了Fc段的潜在免疫原性。

当前研究存在三个待完善方向：1）样本量限制（n=15）可能影响抗体库的多样性，未来需扩大至50名以上志愿者；2） Fabκ链出现阅读框移位问题，推测与λ链的剪接机制差异有关；3）尚未验证体内中和效果，计划在K14-HPV18转基因小鼠模型中开展治疗性试验。结构生物学数据显示，VLP18-Fab与L1蛋白的接触面达280?2，其中Asp548与Arg945形成盐桥，Gln923与Fab的CDR1区形成氢键网络，这种立体构象为后续抗体改造提供了明确靶点。

该成果为HPV相关疾病治疗开辟新路径。传统HPV疫苗（如Gardasil9）虽能预防感染，但对已感染者或免疫抑制人群无效。VLP18-Fab通过阻断病毒与基底膜细胞受体结合（竞争性抑制实验显示IC50=12.5ng/mL），在体外72小时即可清除持续感染状态。值得注意的是，该抗体对HPV16/31/45等高危型别VLPs也表现出交叉反应（OD值提升30-50%），提示可能存在广谱中和潜力。

产业化方面，研究团队已建立标准化生产流程：通过优化IPTG诱导条件（16℃过夜培养），使Fab表达量达2.1mg/L；采用镍螯合层析纯化（纯度>85%），结合超滤浓缩技术（0.22μm膜孔径）。成本估算显示，单克隆抗体年产量可达200kg，成本较传统噬菌体技术降低40%。目前与多家生物制药企业达成合作意向，计划在2025年前完成临床前候选药物（CND）开发。

该研究对HPV疫苗研发具有启示意义：传统疫苗主要诱导IgG抗体，而VLP18-Fab作为单链Fab片段，具有更优的穿透细胞屏障能力和更低的空间位阻。结构模拟显示，抗体结合位点位于VLP的五聚体环状结构域，这与已发表的HPV16中和抗体结合位点（Asp542、Glu543）高度保守。未来可能通过定向进化（如芽孢噬菌体进化技术）将KD值优化至10^-7 M量级。

在公共卫生层面，该技术可快速响应新HPV变异株。例如，针对HPV33新型变体（V528I突变），通过同源重组技术可在3周内完成抗体库更新和阳性克隆筛选。这对疫苗迭代升级（如Gardasil11→Gardasil9→Gardasil13→Gardasil18）具有技术储备价值。

综上，该研究不仅成功构建了首个HPV18特异性Fab抗体库，更建立了从基因工程到临床前评估的完整技术链条。其核心创新在于：1）开发基于VLP的梯度筛选系统；2）建立抗体-病毒复合物三维结构预测模型；3）发现Fab片段的穿透优势。这些突破为HPV相关疾病（如浸润性宫颈癌、复发性生殖器疣）提供了新型治疗工具，同时为疫苗设计优化（如表位覆盖率提升）指明了结构生物学方向。