祖先序列重建与理性蛋白质设计提升了Helveticin NX371对蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的溶菌酶活性

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《Food Bioscience》：Ancestral Sequence Reconstruction and Rational Protein Design Enhances Lysozyme Activity of Helveticin NX371 Against Bacillus cereus

【字体：大中小】 时间：2025年12月05日 来源：Food Bioscience 5.9

编辑推荐：

　　Bacillus cereus 是主要食物源性病原体，研究通过理性蛋白设计提升乳杆菌菌素 helveticin NX371 的抑菌活性，发现突变体 E82L+A290N 活性提升246%，MIC降低至16.4%，为开发新型食品防腐剂提供理论依据。

孙庆|郝勇|刘云斌|卢兆新|孟凡强

南京农业大学食品科学与技术学院，中国南京210095，魏岗1号

摘要

蜡样芽孢杆菌是一种主要的食源性病原体，与富含碳水化合物的食物相关。当前的研究重点在于如何在保持食品质量的同时，对受到蜡样芽孢杆菌污染的食品进行保鲜。本研究以瑞士乳杆菌 NX2-6中鉴定出的helveticin NX371作为主要研究对象。通过分析其进化关系、构建祖先序列、模拟蛋白质结构以及分子动力学等方法，发现helveticin NX371的活性中心由Glu50和Asp81组成，这两个位点与卵液溶菌酶的活性位点一致。随后，利用动力学数据对蛋白质进行了合理设计，以改变helveticin NX371活性中心周围的疏水性，并增加能够与底物形成氢键的氨基酸数量。最终成功开发出E82L+A290N突变体，其溶菌酶活性提高了246%。与野生型helveticin NX371相比，该突变体对蜡样芽孢杆菌的最小抑菌浓度（MIC）降低了16.4%。本研究表明，基于蛋白质结构预测和分子动力学模拟的合理蛋白质设计方法可以有效提高helveticin NX371的溶菌酶活性。这些发现为抗菌蛋白的设计提供了新的见解，并提出了预防和控制食源性病原体（特别是蜡样芽孢杆菌）的创新策略。

引言

蜡样芽孢杆菌是一种常见的革兰氏阳性细菌，存在于多种自然环境中¹。它具有显著的环境适应性和抗逆性，能够在高温、紫外线辐射和化学消毒剂等极端条件下存活²。这种微生物是导致食源性疾病的常见原因，主要表现为呕吐和腹泻症状³。这些食源性疾病的主要致病因素是蜡样芽孢杆菌产生的肠毒素，这些毒素耐热性强，在高温下仍具有活性。蜡样芽孢杆菌的孢子能够在米饭和米粉等食品中产生毒素，从而引发食物中毒事件^{4, 5}。在美国，每年约有63,000例由蜡样芽孢杆菌引起的食源性疾病报告，其中炸饭是主要的传播媒介^{6, 7}。同样，在中国，蜡样芽孢杆菌也是导致食源性疾病爆发的第四大常见细菌⁸。2010年至2020年间，中国发生了400多起与蜡样芽孢杆菌相关的疫情，导致至少7,892例病例、2,786人住院和5人死亡^{6, 9}。由于方便快捷，预加工米饭越来越受到消费者的青睐，尤其是在年轻人群中。2023年，预加工米饭市场的价值达到了32.56亿元人民币，同比增长率为7.99%。预计到2030年，这一市场将达到46.66亿元人民币。尽管预加工米饭具有诸多优点，但由于其富含碳水化合物，容易受到蜡样芽孢杆菌的污染^{8, 10}。在无法进行超高温（UHT）灭菌的预加工食品中，苯甲酸和山梨酸等化学防腐剂仍然是延长保质期的主要手段。然而，使用这些防腐剂存在抗菌素耐药性发展和潜在的健康/环境问题的风险。在这种背景下，抗菌肽（如细菌素）作为一种有前景的替代品应运而生。特别是来自乳酸菌的细菌素对蜡样芽孢杆菌表现出显著的抑制作用^{11, 12, 13}。例如，由植物乳杆菌产生的plantaricin JLA-9能够显著抑制蜡样芽孢杆菌，通过破坏其细胞膜的完整性来干扰其氧化代谢活动和孢子形成¹⁴。此外，环状细菌素如Bacicyclicin XIN-1和cerecyclin也被证明可以抑制蜡样芽孢杆菌的孢子形成¹⁵。其他研究还表明，Subtilisin L和Plantaricin GZ1-27等细菌素也对蜡样芽孢杆菌具有抑制作用^{16, 17}。在之前的研究中，我们从瑞士乳杆菌 NX2-6中成功分离并表征了一种III类细菌素helveticin NX371¹⁸。这种细菌素具有广谱抗菌活性，能有效抑制革兰氏阴性和阳性细菌；同时具有较宽的pH耐受范围，显示出广泛的应用潜力。

为了提高helveticin NX371的效力，本研究旨在采用蛋白质合理设计方法预测其活性位点，并构建更有效的抗菌蛋白以增强其对蜡样芽孢杆菌的抑制效果。随后，我们将有意将蜡样芽孢杆菌接种到预煮米饭中，以评估helveticin NX371的抑制效果。

部分内容

分子伴侣蛋白可提高helveticin NX371的溶解度

从瑞士乳杆菌 NX2-6中鉴定出一种III类细菌素（helveticin NX371），并通过在大肠杆菌中的包涵体表达/复性进行了测试。该细菌素具有类似溶菌酶的活性，并对革兰氏阳性细菌（如金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌）表现出强烈的抗菌效果，显示出作为食品防腐剂的潜力。然而，研究发现复性后的helveticin NX371在不同批次间的稳定性存在差异（图2）。分子筛测试表明，复性过程会导致

讨论

传统的食品防腐剂如苯甲酸钠、山梨酸钾和亚硫酸盐虽然常见，但可能会引发各种健康问题，无法满足消费者对更健康选项的需求^{19, 20}。因此，开发安全、高效且可降解的防腐剂是食品保鲜研究的关键焦点^{21, 22}。乳酸菌产生的细菌素具有广谱抗菌活性和高效力，例如nisin、sakacin和plantaricin等化合物

材料与菌株

卢里亚-贝尔塔尼（LB）培养基由青岛海博生物技术有限公司提供，用于细菌培养和蛋白质表达。N-乙酰葡萄糖胺（NAG）和Micrococcus lysodeikticus购自Sigma-Aldrich有限公司。烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶、高保真度DNA聚合酶和无缝克隆试剂盒购自Takara生物技术有限公司。