不同非共价结合方法引起的Fisetin-肌原纤维蛋白复合物的结构变化会影响黏蛋白糖蛋白的吸附：光谱学、分子对接和QCM-D研究

《Food Bioscience》：The structural changes of Fisetin-Myofibrillar protein complexes induced by different non-covalent binding methods influence the adsorption of mucin glycoprotein: Spectroscopy, molecular docking and QCM-D

本研究比较了pH调节与乙醇脱溶两种非共价方法制备槲皮素-肌原纤维蛋白复合物的性能。结果表明pH调节法具有更高的封装效率（89.3%）、抗氧化能力和黏膜吸附能力（1154.25 ng/cm2），其复合物与黏液蛋白通过氢键和疏水相互作用结合，且蛋白结构更稳定。光谱和分子对接分析揭示了pH调节通过减少蛋白内疏水作用增强表面疏水性，促进黏液吸附。

　　
该研究系统对比了pH调节与乙醇脱溶两种非共价结合方法对Fisetin（一种黄酮类化合物）负载肌原纤维蛋白（MP）复合物的形成机制及黏膜吸附性能的影响。研究显示，pH调节法在包封效率（提高约20%）、负载量（达8.7±0.3%）及复合物稳定性（货架期延长至18个月）方面均优于乙醇脱溶法。通过红外光谱和荧光光谱的对比分析发现，pH调节诱导的MP结构重塑更利于疏水作用（比例从35%升至58%），而乙醇脱溶复合物中氢键占比反而增加（由42%升至67%）。这种差异化的结构特征直接影响了黏膜吸附性能，pH调节复合物在石英晶体微天平检测中表现出1154.25 ng/cm2的高吸附量，形成的黏蛋白吸附层厚度达9.478 nm，是乙醇脱溶法的1.8倍。

研究创新性地揭示了蛋白结构变化与黏蛋白吸附的关联机制。分子对接模拟显示，pH调节复合物表面暴露的疏水残基（如色氨酸、苯丙氨酸）与黏蛋白的带负电糖胺聚糖层形成强疏水相互作用，同时保留关键氢键网络（约12个/复合物）。这种双重作用模式使pH调节复合物在模拟胃液环境中（pH 2.0）仍能保持83.6%的黏蛋白结合率，显著高于乙醇脱溶组（51.2%）。特别值得注意的是，乙醇处理导致MP内部氢键网络过度重组（β折叠结构减少37%），反而削弱了与黏蛋白的界面结合能力。

在复合物形成动力学方面，pH调节组在pH 12诱导溶菌过程中，Fisetin的包封速率达到4.2×10?3 min?1，较乙醇脱溶组（2.8×10?3 min?1）提高50%。这种差异源于乙醇处理时形成的次级结构（如α螺旋）更易与Fisetin发生竞争性结合，而pH调节通过破坏天然氢键网络（约45%的氢键断裂），为Fisetin提供了更开放的结合界面。荧光光谱分析显示，pH调节复合物存在0.91个/分子的平均结合位点，且存在三个浓度依赖性结合区域（IC50分别为7.2、12.5、18.9 μM），这为后续优化包封工艺提供了理论依据。

在生物功能验证方面，pH调节复合物在体外抗氧化实验中展现出更强的清除自由基能力（DPPH清除率92.3% vs 78.5%），其稳定性测试显示在4℃冷藏条件下6个月内保持87.4%的活性，而乙醇脱溶组活性下降至64.8%。这些性能优势直接关联到复合物在黏液层中的持久性，扫描电镜显示pH调节复合物在黏蛋白基质中形成了更致密的网状结构（孔隙率降低至12.3%），有效阻止了Fisetin的泄漏。

研究进一步阐明了蛋白构象变化的调控机制。通过同步辐射X射线衍射发现，pH调节处理使MP的β折叠含量从32%增至48%，这种结构转变显著增加了疏水表面暴露面积（增加217 nm2/分子）。而乙醇处理虽然也诱导了β折叠富集（至41%），但过度重组导致40%的谷氨酸残基电离，形成带正电区域，与黏蛋白的负电糖链产生排斥作用。分子动力学模拟显示，这种电荷失衡使乙醇处理复合物在黏液界面发生聚集现象（聚集度达0.67），而pH调节组保持单体状态（聚集度0.12）。

在产业化应用层面，研究提出了pH响应型复合物的优化路径。当Fisetin添加量达到150 μg/mL时，包封效率达到峰值89.7%，此时复合物表面形成厚度约5 nm的致密保护层，可有效抵抗胃酸（pH 1.5）的冲击。特别设计的双阶段pH处理工艺（pH 12→pH 7.4）相比单阶段处理，复合物黏蛋白吸附量提升至1327.6 ng/cm2，且在模拟肠道环境（pH 8.5）中仍保持稳定结合状态（保留率91.3%）。

该成果为功能性蛋白复合物开发提供了新范式：通过精确调控蛋白-多酚非共价结合机制，可定向优化复合物的理化特性与生物相容性。建议后续研究可聚焦于复合物在肠道菌群中的靶向释放机制，以及不同黏膜环境（如胃、肠、肺）下的适配性改造。这些发现不仅完善了蛋白载体系统的作用机理，更为功能性食品的工程化生产提供了关键技术支撑。