基于单细胞和批量RNA转录组测序数据，识别与溃疡性结肠炎相关的液-液相分离生物标志物

《Endocrine Metabolic & Immune Disorders - Drug Targets》：Identification of Biomarkers Related to Liquid-Liquid Phase Separation for Ulcerative Colitis Based on Single-Cell and Bulk RNA Transcriptome Sequencing Data

本研究通过整合单细胞转录组测序与 bulk RNA-seq 数据，筛选出 Ulcerative Colitis (UC) 中 5 个关键生物标志物基因（PLA2G2A、GZMK、CD69、HSP90B1、S100A11），并验证其诊断价值，揭示液态液态相分离（LLPS）在 UC 发病机制中的作用，为早期诊断和治疗提供新方向。

　　
本研究系统探究了液态-液态相分离（LLPS）与溃疡性结肠炎（UC）的关联性，通过整合单细胞转录组测序与 bulk RNA测序数据，结合生物信息学分析与实验验证，揭示了LLPS相关基因在UC中的关键作用。研究团队以GEO数据库中的单细胞数据集（GSE214695）和 bulk数据集（GSE875466）为研究对象，首先通过Seurat包完成数据预处理，利用UMAP算法进行降维聚类，成功鉴定出纤维母细胞、巨噬细胞、上皮细胞等8种主要细胞类型，并进一步细分出17个亚群。这一发现为后续研究提供了细胞层面的精准定位基础。

在LLPS相关基因筛选方面，研究团队通过DrLLPS数据库获取了3598个LLPS相关基因（LLPSRGs），结合ssGSEA算法计算各细胞亚群LLPS关联评分，筛选出上皮细胞、T细胞、NK细胞等5类关键细胞。通过交叉验证发现，44个同时满足单细胞分析、bulk数据差异表达及LLPS评分显著性的基因成为候选分子。基于机器学习模型（LASSO回归与SVM-RFE）的筛选进一步缩小至PLA2G2A、GZMK、CD69、HSP90B1、S100A11五个核心基因。这些基因在UC患者中的表达量较健康对照组显著升高（AUC值均超过0.9），其中PLA2G2A与CD69的AUC值分别达到0.95和0.94，显示出卓越的诊断效能。

功能富集分析显示，这五个基因主要富集于免疫相关通路（如MHC蛋白复合物、免疫应答）、细胞运输过程（如内质网至高尔基体运输）以及感染相关通路（如弧菌感染、大肠杆菌感染）。蛋白质相互作用网络（PPI）进一步揭示，这些基因通过形成复杂的分子互作网络调控UC发病机制。值得注意的是，HSP90B1作为内质网应激的关键调控因子，其突变体在UC结肠组织中的乙酰化水平异常升高，可能通过影响NF-κB信号通路加剧炎症反应。

在治疗潜力方面，研究团队通过药物相互作用数据库（CTD）筛选出五种候选药物：脱氧胞苷（作用于PLA2G2A）、四氯二苯二恶英（调控GZMK）、角鲨烯酸甲酯（靶向CD69）、HSP90B1抑制剂（如Thapsigargin）以及S100A11相关小分子。其中，脱氧胞苷在动物模型中已被证实可通过抑制IL-17和IL-6分泌改善DSS诱导性结肠炎症状，而四氯二苯二恶英通过激活芳烃受体（AhR）通路促进PGE2合成，在体外实验中显示出调节Treg/Th17细胞平衡的潜力。

免疫浸润分析表明，UC患者结肠组织中M1型巨噬细胞、记忆性CD4+ T细胞、中性粒细胞等促炎细胞亚群浸润比例显著增加（p<0.05），而M2型巨噬细胞、调节性T细胞（Tregs）等抗炎细胞则呈现下降趋势。这种免疫微环境的失衡与LLPS相关基因的高表达形成正反馈循环，导致肠道屏障破坏和慢性炎症。研究特别指出，CD69作为激活标记物，其表达水平与疾病活动度评分（DAI）呈正相关（r=0.78），提示该分子可能成为疾病严重程度评估的新指标。

实验验证部分采用qRT-PCR技术对手术获取的UC患者和健康对照结肠组织进行检测，结果显示PLA2G2A、CD69、HSP90B1、S100A11四基因在UC组织中的mRNA水平均显著高于对照组（p<0.01），其中PLA2G2A在UC患者中的表达量达到健康对照组的3.2倍（95%CI:2.7-3.8）。外部数据集（GSE36807）的验证进一步支持了这一结论，交叉验证结果显示模型诊断一致性达到89.7%。

研究创新性地将LLPS理论引入炎症性肠病机制研究。通过单细胞测序发现，UC患者肠道上皮细胞中LLPS相关蛋白的聚集程度较健康组织提高42%，这种膜内含体结构的改变可能通过破坏细胞间通讯和免疫调节网络促进疾病进展。特别是GZMK基因编码的Granzyme K在T细胞活化过程中通过形成相分离微区增强信号转导效率，这一发现为理解UC中Th17细胞过度活化提供了新机制。

讨论部分指出当前研究的局限性：样本量（n=12）较小可能影响统计效力，未涵盖遗传多样性差异，且部分候选药物（如Thapsigargin）的体内疗效仍需验证。但研究首次证实LLPS机制在UC中的核心地位，为开发基于相分离调控的新型疗法提供了理论依据。后续研究计划通过构建类器官模型和转基因小鼠验证关键基因的功能，并开展多中心临床研究评估生物标志物的临床适用性。

该研究在多个层面实现突破：1）建立首个LLPS相关基因在UC中的系统评估框架；2）发现CD69作为炎症反应的时空标志物；3）揭示HSP90B1通过内质网应激调控轴的致病机制；4）提出基于LLPS微环境调控的五联疗法概念。这些成果不仅为UC的早期诊断提供了分子工具包（包含PLA2G2A、CD69等5个核心生物标志物），更为靶向相分离过程的药物研发开辟了新路径，例如开发可特异性抑制HSP90B1乙酰化修饰的小分子抑制剂，或通过调节LLPS微环境重塑免疫细胞功能。