《Drug Metabolism and Disposition》：Inhibition of cytochrome P450 2B6 activity by dihydromethysticin: Structural and mechanistic insights
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CYP2B6抑制研究中，二氢甲氧基芪星（(+)-dihydromethysticin）被证实为最 potent的立体选择性抑制剂，其 Ki值为0.2 μM。研究揭示了11,12-甲氧基二苯基团是抑制关键结构，并证实该团可能在CYP2B6催化下形成代谢物-抑制剂复合物。通过比较对映体、氟代及去甲氧基类似物的抑制活性，证实甲氧基二苯基团与CYP2B6活性位点的铁血红素结合位点是必要的。该化合物作为选择性CYP2B6抑制剂探针具有重要临床应用潜力。
潘芬·王（Pan-Fen Wang）|邢成国（Chengguo Xing）|埃文·D·卡拉斯奇（Evan D. Kharasch）
杜克大学医学院麻醉学系，北卡罗来纳州达勒姆
摘要
(+)-二氢紫水晶素（(+)-Dihydromethysticin）是从卡瓦植物（kava plants）中分离出的一种主要卡瓦内酯（kavalactone）。先前的研究表明，(+)-二氢紫水晶素是一种CYP2B6抑制剂，具有独特的结构特异性。它是迄今为止发现的最强效的CYP2B6抑制剂，而CYP2B6是所有CYP亚型中对二氢紫水晶素抑制作用最敏感的。本研究利用表达的CYP2B6以及探针底物7-乙氧基-4-三氟甲酰香豆素（7-ethoxy-4-trifluoromethyIcoumarin）和S-氯胺酮（S-ketamine），评估了二氢紫水晶素对CYP2B6的抑制作用及其分子机制，特别是甲基二氧基苯基（methyleneedioxyphenyl）基团在抑制过程中的作用。非天然对映体(-)-二氢紫水晶素和外消旋体(±)-二氢紫水晶素表现出相似的抑制活性。两种对映体的Ki值均为0.2 μM，属于非竞争性抑制剂。缺乏甲基二氧基团的二氢紫水晶素类似物在CYP2B6代谢检测中无抑制效果。当二氢紫水晶素中的甲基氢原子被二氟取代时，其抑制活性消失；而双氘取代对其抑制作用无影响。两种对映体及其双氘类似物均产生了与代谢物-抑制剂复合物一致的谱图特征。结果表明，二氢紫水晶素在CYP2B6的作用下可转化为代谢物-抑制剂复合物，进而导致酶活性抑制。二氢紫水晶素可能具有作为选择性CYP2B6抑制剂探针的临床应用潜力。
引言
Cytochrome P450 2B6（CYP2B6）虽然仅占肝脏CYP酶总量的小部分，但它能代谢多种具有临床意义的治疗化合物，包括R,S-美沙酮（R,S-methadone）、R,S-安非他酮（R,S-bupropion）、R,S-氯胺酮（R,S-ketamine）、S-依非韦伦（S-efavirenz）、R,S-奈韦拉平（R,S-nevirapine）、丙泊酚（propofol）、尼古丁（nicotine）、青蒿素类化合物（artemesinins）、环磷酰胺（cyclophosphamide）、异丙环磷酰胺（ifosfamide）、塞来吉兰（selegiline）和哌替啶（meperidine）等。1, 2CYP2B6催化的底物转化包括胺类化合物α碳的氧化（释放游离氨基，如美沙酮、氯胺酮、塞来吉兰、哌替啶）、烷基醚的α碳氧化导致O-脱烷基化（如青蒿醚、7-乙氧基香豆素）、芳香环的羟基化（如依非韦伦、丙泊酚）以及吡啶环的羟基化（如奈韦拉平），这些过程可能导致底物的生物活化或失活。3, 4CYP2B6易受到药物抑制或诱导作用的影响，从而改变药物的药代动力学。3, 4例如，基于机制的CYP2B6抑制剂噻氯匹定（ticlopidine）能显著且立体选择性地抑制美沙酮的N-脱甲基化，降低血浆中代谢物的生成并提高美沙酮浓度5；CYP2B6抑制剂伏立康唑（voriconazole）也有类似效果6。同样，安非他酮的羟基化过程也会受到CYP2B6抑制剂噻氯匹定和氯吡格雷（clopidogrel）的抑制，导致羟基化产物的生成减少、血浆浓度下降以及安非他酮清除率降低、血浆浓度升高7。
我们最近筛选了一类具有多样分子结构的天然产物化合物，这些化合物传统上用于草药或合成类似物中，旨在研究其对CYP2B6活性的抑制作用，特别是对CYP2B6介导的美沙酮代谢的抑制效果。从南太平洋岛国原产的卡瓦植物（Piper methysticum）中分离出的六种主要卡瓦内酯之一——二氢紫水晶素（图1），被证实是效力最强的CYP2B6抑制剂，其Ki值为0.074 μM9。分子建模揭示了抑制剂在CYP2B6活性位点的结合位置和取向，以及其与CYP2B6残基的相互作用，尤其是(+)-二氢紫水晶素的甲基二氧基团与CYP血红素铁的潜在相互作用。天然产物对CYP2B6的抑制作用表现出一定的结构特异性：二氢紫水晶素是强效且竞争性的抑制剂，而仅在其连接段含有双键的甲基紫水晶素（methysticin）则具有非竞争性抑制作用，活性低约3个数量级10, 11。
卡瓦内酯（尤其是二氢紫水晶素）对CYP2B6的抑制作用具有显著的结构特异性。研究结构-活性关系对于药物发现及探索分子结构对功能活性的影响至关重要。在本研究中，我们将对二氢紫水晶素的研究扩展到一类结构相关的合成类似物（图1）。通过使用探针底物7-乙氧基-4-三氟甲酰香豆素（7-ETFMC）和S-氯胺酮进行检测，评估了这些类似物的CYP2B6抑制活性。由于二氢紫水晶素芳香环上的11,12-甲基二氧基团是其抑制CYP2B6所必需的结构基团9，且已知甲基二氧基苯基基团能通过特定机制抑制CYP酶10, 1112，因此本研究重点关注了该基团的结构修饰。同时，我们也探讨了二氢紫水晶素对CYP2B6抑制作用的立体化学特性。
材料与方法
CYP2B6、P450还原酶和细胞色素b5的质粒构建以及重组杆状病毒的制备方法参照先前文献13进行。重组蛋白CYP2B6、P450还原酶和细胞色素b5通过昆虫细胞 triple infection 技术表达13, 14，CYP2B6:P450还原酶:b5的比例为1:2:4。光谱分析时，CYP2B6和P450还原酶共表达，比例为1:1；细胞色素b5未参与实验
CYP2B6抑制的卡瓦内酯特异性
首先使用7-乙氧基-4-三氟甲酰香豆素（7-ETFMC）作为底物，评估了二氢紫水晶素及其类似物对CYP2B6活性的抑制作用。该方法快速、经济且灵敏。实验中底物浓度固定为50 μM，抑制剂浓度分别为0.1、1和10 μM。除了7-ETFMC检测外，还采用了另一种评估方法
讨论
本研究的目的是探讨二氢紫水晶素抑制CYP2B6的机制和结构要求。先前研究表明，含有甲基二氧基苯基的卡瓦内酯比不含该基团的化合物具有更强的CYP2B6抑制作用9。例如，二氢卡瓦因（dihydrokavain）虽然分子结构与二氢紫水晶素相同，但缺乏甲基二氧基团，其Ki值较低
声明
本手稿的撰写过程中未使用任何生成式人工智能（generative AI）技术
作者贡献
潘芬·王（PFW）：研究设计、数据分析、初稿撰写、审阅与编辑
邢成国（Chengguo Xing）：资源获取、审阅与编辑
埃文·D·卡拉斯奇（Evan D. Kharasch）：概念构思、指导、初稿撰写、审阅与编辑
CRediT作者贡献声明
潘芬·王（Pan-Fen Wang）：审阅与编辑、初稿撰写、数据分析、概念构思
邢成国（Chengguo Xing）：审阅与编辑、资源获取
埃文·D·卡拉斯奇（Evan D. Kharasch）：审阅与编辑、初稿撰写、指导、概念构思
