壳聚糖包覆的ZnO纳米粒子的合成与生物学评价：对小鼠胚胎成纤维细胞中成纤维细胞分化、线粒体健康及氧化应激的影响

《Chinese Journal of Chemical Engineering》：Synthesis and Biological Evaluation of Chitosan-Coated ZnO Nanoparticles: Impact on Fibroblast Differentiation, Mitochondrial Health, and Oxidative Stress in Mouse Embryonic Fibroblast Cells

本研究合成了壳聚糖修饰的氧化锌纳米颗粒（CS-ZnO NPs），通过TEM、UV可见光谱、XRD和FTIR表征其形貌与结构，并评估其对小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的细胞毒性、线粒体膜电位及ROS水平影响。结果表明，CS-ZnO NPs显著降低细胞毒性，维持线粒体完整性和ROS平衡，同时上调Prdm1和Prdm14 mRNA表达，证明壳聚糖修饰可有效减少ZnO NPs毒性并保留其生物活性，为生物医学应用提供新思路。

　　

Mati Ullah | Haiyu Li | Rahman Ullah | Xingfeng Che | Muhammad Waqqas Hasan | Omotoso Ifeoluwa | Fangzhou Song

重庆医科大学分子医学与癌症研究中心，中国重庆市渝中区医学院路1号，400016

摘要

纳米颗粒的表面功能化已成为提高其生物性能并降低细胞系统中毒性的关键策略。我们合成了壳聚糖功能化的氧化锌（CS-ZnO纳米颗粒），并通过透射电子显微镜（TEM）、紫外-可见光谱（UV-Vis spectroscopy）、X射线衍射（XRD）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）对其进行了进一步表征。通过评估线粒体膜电位（JC-1染色）、活性氧（ROS）的产生（DCFH-DA测定）以及分化调节因子Prdm1和Prdm14的表达（通过qPCR检测），研究了这些纳米颗粒对小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的生物效应。与未经改性的ZnO纳米颗粒相比，CS-ZnO纳米颗粒表现出较低的细胞毒性，同时保持了线粒体完整性和ROS的稳态，并上调了Prdm1和Prdm14的mRNA水平。这些发现表明，壳聚糖功能化有效减轻了ZnO纳米颗粒的细胞毒性，同时保留了其生物活性，为生物医学应用带来了广阔前景。

引言

氧化锌（ZnO）纳米颗粒因其多功能性和可通过多种物理、化学和生物方法相对容易合成而成为广泛研究的金属氧化物纳米材料[1]、[2]、[3]。ZnO纳米颗粒由于其较大的表面积以及抗菌、抗癌、纺织和伤口愈合等多种生物医学应用而受到关注[4]、[5]、[6]、[7]、[8]。ZnO纳米颗粒具有优异的细胞摄取效率和强蛋白质结合亲和力，这使得它们易于在生物科学中发挥作用，因为它们能够轻易穿透人体细胞并与蛋白质结合。生物合成方法的最新进展使得开发出具有更好生物相容性和针对特定生物医学应用定制特性的环保型ZnO纳米颗粒成为可能，尤其是在组织工程和伤口愈合模型中[9]、[10]。这些发展为将ZnO纳米颗粒应用于再生医学和先进治疗平台提供了创新机会。

成纤维细胞，特别是小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），在组织修复、细胞外基质重塑和纤维化发展中起着关键作用[11]。已有研究表明，ZnO纳米颗粒会影响成纤维细胞的增殖和分化，这些过程对于伤口愈合、组织再生和纤维化管理至关重要[12]、[13]、[14]、[15]。尽管ZnO纳米颗粒具有治疗潜力[16]，但其生物医学应用常常受到剂量依赖性细胞毒性的限制，这主要是由于活性氧（ROS）的过度产生、线粒体功能障碍以及随之而来的细胞过程紊乱[17]、[18]、[19]。

使用生物相容性材料对纳米颗粒进行表面修饰被认为是提高其稳定性和降低毒性的方法[20]。壳聚糖（CS）是一种天然来源的生物聚合物，其主链上含有丰富的氨基（-NH₂）和羟基（-OH）官能团。这些活性位点通过螯合和静电相互作用等多种机制有效去除重金属离子[21]、[22]。壳聚糖作为一种出色的生物相容性涂层材料，不仅增强了纳米颗粒的稳定性，还显著降低了毒性，并通过其独特的物理化学性质提高了细胞摄取效率[23]、[24]。通过在ZnO纳米颗粒周围形成保护层，壳聚糖可以改善稳定性、调节ROS的产生并促进有益的细胞相互作用，使其成为优化基于ZnO的纳米材料用于治疗应用的有前景的策略[25]、[26]。此外，壳聚糖和ZnO已被应用于多个领域，包括癌症研究、抗菌活性、废水分离中的染料应用、农作物的采后质量改进以及药物递送[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]。

在这项工作中，我们研究了ZnO纳米颗粒的表面功能化如何通过调节成纤维细胞中的线粒体和氧化应激来提高其生物相容性。我们合成了CS-ZnO纳米颗粒，并系统地研究了它们对小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的生物效应。在纳米颗粒暴露后72小时，我们评估了ATP的产生、线粒体膜电位、氧化磷酸化效率以及细胞内ROS的水平。研究结果为工程纳米材料与成纤维细胞之间的生物界面提供了见解，支持了CS-ZnO纳米颗粒在组织工程、再生医学和抗纤维化治疗中的潜在应用。

材料

醋酸锌二水合物（ZnAc₂·2H₂O，纯度98%）、氢氧化钠（NaOH，纯度99%）、低分子量壳聚糖（3000 Da，脱乙酰度≥90%）、醋酸（CH₃COOH，纯度99%）和柠檬酸三钠（Na₃C₆H₅O₇，纯度98%）均购自广州金华达化学试剂有限公司（中国）。JC-1染料、2′,7′-二氯荧光素二乙酸盐（DCFH-DA）、一级抗体（anti-PRDM1）、二级抗体（anti-PRDM14）、DAPI或Hoechst染色剂（用于核染色）等试剂也用于实验。

制备和固态表征

ZnO纳米颗粒及其壳聚糖功能化产物CS-ZnO纳米颗粒的制备采用了一种成熟的湿化学方法，以确保高纯度、稳定性和可控的形态。图1展示了ZnO和CS-ZnO纳米颗粒的物理化学特性。图1(a)和1(b)中的TEM图像显示了ZnO和CS-ZnO纳米颗粒之间的结构差异。图1(a)中的ZnO纳米颗粒形状不规则，

结论

本研究致力于合成ZnO纳米颗粒和CS-ZnO纳米颗粒，以提高其生物相容性和降低毒性。通过TEM、UV-Vis、XRD和FTIR的全面评估，验证了纳米颗粒的大小、形状和表面修饰情况。生物实验表明，与未涂层的ZnO纳米颗粒相比，CS-ZnO纳米颗粒的细胞毒性显著降低，对线粒体膜电位和活性氧的影响也很小。

作者贡献声明

Haiyu Li：撰写——审稿与编辑，实验研究。 Mati Ullah：撰写——初稿，方法学设计，实验研究。 Rahman Ullah：软件操作，资源准备。 Muhammad Waqqas Hasan：数据管理。 Xingfeng Che：资源协调。 Fangzhou Song：撰写——审稿与编辑，项目监督。 Omotoso Ifeoluwa：概念构思。

伦理批准

不适用

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

利益声明

作者声明没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了以下机构的支持：重庆市璧山区科学技术局和重庆中医药大学支持的青年科学家合作研究基金（BSLHZX007），以及重庆市璧山区社会民生科技项目（BSKJ2024084）。