ZNF655通过调节Akt/Nrf2通路在脑缺血-再灌注损伤中发挥神经保护作用

《Brain Research》：ZNF655-mediated neuroprotection in cerebral ischemia-reperfusion injury via Akt/Nrf2 pathway modulation

缺血再灌注损伤中ZNF655通过激活Akt/Nrf2通路减轻神经细胞凋亡、氧化应激和炎症反应。采用OGD/R模型和SH-SY5Y细胞，过表达ZNF655显著降低细胞凋亡率（p<0.01），提升 Akt磷酸化水平，促进Nrf2核转位及下游抗氧化基因表达，抑制DCFH-DA荧光强度（p<0.01）和IL-6、TNF-α等炎症因子释放。

　　

魏万毅|吴宗凯|岳红红|张洋|王和波

中国河北省石家庄市，河北医科大学神经内科，邮编050017

摘要

背景

脑缺血-再灌注损伤（CIRI）涉及复杂的病理过程，包括氧化应激、炎症反应和细胞凋亡。锌指蛋白655（ZNF655）参与调控Akt信号通路，该通路通过磷酸化作用激活核因子红细胞2相关因子2（Nrf2），从而增强其稳定性和转录活性。这条通路在介导抗氧化防御、抑制炎症和抑制细胞凋亡方面起着关键作用。本研究旨在探讨ZNF655通过调节Akt/Nrf2信号级联反应在CIRI中的潜在神经保护作用。

方法

使用SH-SY5Y细胞建立了一种体外CIRI模型，这些细胞首先经历缺氧-葡萄糖剥夺（OGD）然后是再氧合（OGD/R）。细胞被感染编码ZNF655的腺病毒载体以上调ZNF655的表达。mRNA水平通过实时定量PCR（RT-qPCR）测定。蛋白质水平通过免疫印迹法确定。细胞活力通过CCK-8试剂盒检测。细胞凋亡通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口末端标记（TUNEL）方法评估。氧化应激通过二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针监测。炎症细胞因子的释放通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测。

结果

与常氧对照组相比，OGD/R条件下ZNF655的表达显著下调。ZNF655的过表达显著减轻了OGD/R诱导的细胞凋亡、氧化应激和促炎细胞因子的产生。ZNF655促进了Akt的磷酸化，促进了Nrf2向细胞核的转运，并上调了下游抗氧化基因的表达。

结论

药物抑制Akt或沉默Nrf2会减弱ZNF655的神经保护作用。这些发现表明，ZNF655通过激活Akt/Nrf2信号通路发挥神经保护作用，对抗OGD/R引起的损伤。

引言

中风是全球主要的死亡原因之一，也是成人长期残疾的主要原因，其中缺血性中风（IS）占所有中风病例的约87%（Chalos等人，2020年）。IS期间脑血流的突然停止会导致不可逆的神经元损伤，这突显了及时再灌注以恢复脑灌注和限制梗死进展的重要性（Mendelson和Prabhakaran，2021年）。然而，再灌注反而可能诱发脑缺血-再灌注损伤（CIRI），从而加剧最初的缺血损伤（Zhang等人，2024年）。

CIRI包括一系列复杂的病理过程，如兴奋性毒性、氧化应激、神经炎症和程序性细胞死亡（Qin等人，2022年）。缺血后随后的再灌注会促进活性氧（ROS）的过度产生，导致氧化应激、钙平衡紊乱和炎症级联反应的激活。这些相互关联的事件导致受影响脑区的神经元逐渐受损和细胞凋亡（Alsbrook等人，2023年）。因此，针对氧化应激、炎症和细胞凋亡的治疗策略对于减轻CIRI引起的神经功能缺陷至关重要（Zhou等人，2025年；Wu等人，2025年）。

锌指（ZNF）蛋白是人类基因组中最大的转录因子类群，在基因调控和细胞功能中发挥多种作用（Cassandri等人，2017年）。锌指基序的结构多样性，特别是Cys2/His2（C2H2）亚家族中的基序，使这些蛋白能够参与广泛的生物过程，包括发育、分化和肿瘤抑制（Klug和Schwabe，1995年；Razin等人，2012年）。ZNF655属于C2H2型ZNF家族，最初通过酵母双杂交筛选鉴定，已被发现参与多种癌症模型中的细胞增殖、细胞凋亡和分化调节（Houlard等人，2005年；Chen等人，2022年；Shao等人，2022年；Teng等人，2021年）。然而，迄今为止，ZNF655在CIRI中的作用尚未得到研究。

新证据表明，ZNF655通过Akt信号通路调节非小细胞肺癌中的细胞凋亡（Teng等人，2021年）。鉴于Akt和Nrf2信号通路在CIRI病理生理学中的核心作用，ZNF655在缺血损伤中的调节作用是合理的（Wang等人，2022年）。激活Akt/Nrf2轴已被证明可以通过上调抗氧化基因表达来减轻氧化应激，并通过减少缺血-再灌注后的炎症反应和细胞凋亡来发挥神经保护作用（Wen等人，2018年）。

在这项研究中，我们使用SH-SY5Y细胞在缺氧-葡萄糖剥夺和再氧合（OGD/R）的体外模型中探讨了ZNF655的潜在神经保护作用。核心假设是ZNF655通过调节Akt/Nrf2信号通路发挥细胞保护作用。阐明这一机制可能为开发治疗CIRI的新策略提供依据。

部分内容

细胞培养和OGD/R模型

人类SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞（ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯）在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基/Nutrient Mixture F-12（DMEM/F12；Gibco，美国加利福尼亚州）中培养。细胞在37°C、含5% CO₂的湿润环境中培养。为了模拟体外CIRI，基于先前的方法建立了OGD/R模型。简而言之，培养基被无葡萄糖的DMEM替换。

OGD/R处理后ZNF655的表达下调

为了研究ZNF655在CIRI中的潜在作用，使用SH-SY5Y细胞建立了OGD/R模型。定量PCR分析显示，OGD/R处理后的细胞中ZNF655的mRNA水平显著降低（p p

讨论

CIRI指的是在先前缺血的脑区恢复血流后可能发生的继发性神经元损伤（Zeng等人，2022年）。尽管再灌注疗法有所进展，但有效的神经保护策略仍然有限，这对于减轻IS中的CIRI仍然是一个关键问题。作为C2H2型锌指家族成员的ZNF655已被发现参与多种生理过程

结论

本研究的结果表明ZNF655是CIRI背景下的一种新型神经保护因子。ZNF655的保护作用主要通过激活Akt/Nrf2信号通路来实现，从而减轻OGD/R暴露的神经元细胞中的氧化应激、炎症和细胞凋亡。这些发现不仅揭示了ZNF655在脑血管病理生理学中的新作用，还扩展了其功能范围，超出了其已知的角色

作者贡献声明

魏万毅：资源获取、方法学设计、资金申请、数据管理。吴宗凯：验证、软件使用。岳红红：项目监督、项目管理、数据分析。张洋：撰写、审稿与编辑、数据可视化、软件操作。王和波：资源获取、方法学设计、实验实施、数据分析。

资助

中国河北省医学研究项目（项目编号20220886）。

数据可用性声明

所有相关数据均包含在论文中。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们想感谢所有参与研究实施和评估工作的人员的辛勤付出。