《Biosensors and Bioelectronics》：Optimized Fluorescent Probes for Heparan Sulfate Sensing in Live Cells and Human Blood
编辑推荐：
HS蛋白聚糖的实时检测与定位研究。设计含支链肽受体及脂肪酸/PEG修饰的荧光探针，其中PEG修饰探针3能稳定锚定于细胞表面达120分钟，实现HS消耗的定量监测，同时抑制纤维生长因子信号并阻遏癌细胞迁移，且显著降低血清蛋白非特异性结合，提升血液中HS检测灵敏度与选择性。
黄贤贞（Hyun Jung Hwang）| 苏米塔·苏贝迪（Sumita Subedi）| 基肖尔·卡德卡（Kishor Khadka）| 李在善（Jae-Seon Lee）| 李根亨（Keun-Hyeung Lee）
韩国仁川市仁荷大学（Inha University），细胞间通讯控制研究中心（Research Center for Controlling Intercellular Communication）与智能能源材料与工艺研究中心（Education and Research Center for Smart Energy Materials and Process），邮编402-751
摘要
细胞表面的硫酸肝素（HS）蛋白聚糖在细胞信号传导、血管生成、内吞作用、传染病进展以及肿瘤侵袭过程中起着关键作用。由于硫酸肝素的结构异质性和探针内化问题，其在活细胞中的实时检测与定量仍面临挑战。本文报道了经过合理设计的荧光探针（1–3），这些探针结合了带有脂肪酸和/或聚乙二醇（PEG）修饰的分支肽受体，以实现针对硫酸肝素蛋白聚糖的选择性靶向。其中，PEG修饰的探针3在RPMI培养基中对硫酸肝素表现出稳定且选择性的比率荧光响应，并在细胞表面持续定位120分钟。相比之下，脂肪酸修饰的探针2仅在细胞膜处短暂积累约20分钟，随后被内化至细胞质中，从而限制了其在细胞表面的停留时间。值得注意的是，探针3能够在siRNA抑制硫酸肝素硫酸化作用或化学处理后，以及肝素酶消化后，实现对活细胞中硫酸肝素消耗的定量监测；同时还能减弱成纤维细胞生长因子信号传导并抑制癌细胞迁移。此外，PEG修饰降低了与血清非特异性蛋白质的结合，从而提高了在人血液中检测硫酸肝素的灵敏度和选择性。
引言
硫酸肝素（HS）和肝素是高度硫酸化的线性多糖，结构具有异质性，均由相同的单糖单元生物合成（Whitelock和Iozzo, 2005; Sarrazin, 2011）。尽管结构相似，但它们在细胞和体内具有不同的生物学功能。肝素作为抗凝药物广为人知，因为它能与抗凝血酶发生强烈相互作用，促使该蛋白抑制剂发生构象变化。然而，过量使用肝素可能导致严重副作用，如出血和肝素诱导的血小板减少症（Onishi, 2016）。因此，已开发出多种荧光探针用于选择性检测人血清和血浆样本中的肝素（Bromfield等, 2013; Cao等, 2014; Dai等, 2011; Ding等, 2015; Hung和Tseng, 2014; Jagt等, 2009; Kalita等, 2014; Kim等, 2014; Lee和Tseng, 2015; Lee, 2018; Liangfei, 2020; Liu等, 2014; Lühn等, 2011; Pramod, 2017; Stephe, 2013; Thirupathi等, 2015a, 2015b）。
最近的研究表明，血液中硫酸肝素水平异常与多种病理状况相关，包括移植物抗宿主病、黏多糖贮积症和登革热（Brennan, 2012; Nelson, 2014; Tomatsu, 2005）。这些变化主要归因于负责硫酸肝素生物合成的酶过度表达以及溶酶体中硫酸肝素降解受损。硫酸肝素蛋白聚糖（HSPGs）普遍存在于哺乳动物细胞表面（图1），在细胞信号传导、黏附、分化、肿瘤转移和内吞作用等多种生物过程中发挥关键作用（Bishop, 2005; Christianson, 2014; Lin, 2004; Nagarajan, 2018; Richard, 2005; Xu, 2014）。越来越多的证据表明，细胞表面的硫酸肝素可作为共受体，通过邻近效应促进受体-配体复合物的形成，并诱导结合配体的构象变化（Cagno, 2019; Chhabra, 2021; Hayashida, 2022; Liu, 2021）。
为了研究活细胞中硫酸肝素的动态功能，非侵入性和高分辨率成像技术至关重要。传统方法如免疫荧光分析和流式细胞术依赖于昂贵且不稳定的抗体，且通常需要繁琐的操作步骤（Hsu, 2021; Richter, 2022）。相比之下，小分子荧光探针为活细胞中硫酸肝素的可视化提供了有前景的替代方案（Jun, 2020; Kobayashi, 2010; Wang, 2024）。然而，大多数荧光探针含有亲水性荧光团，这些荧光团倾向于与细胞质膜结合并迅速被内化，从而限制了其选择性检测细胞表面硫酸肝素的能力（Jia, 2021; Klymchenko, 2023; Wu, 2024）。
为了解决这些问题，我们先前开发了首个基于肽骨架的比率荧光探针，用于活细胞中HSPGs的选择性可视化（Subedi, 2023）。该探针具有高水溶性、低细胞毒性以及对硫酸肝素的强结合亲和力，其比率荧光特性实现了活细胞中硫酸肝素的定量检测，并最小化了环境对荧光信号的影响（Gui, 2019, Lee 2015）。然而，快速的细胞内化过程限制了其用于长期监测细胞表面硫酸肝素的应用。
为克服这一限制，我们通过替换氨基酸并引入脂肪酸或聚乙二醇（PEG）基团，合理设计了探针的疏水性和细胞穿透能力。在设计的变体中，脂肪酸修饰的探针2最初在细胞质膜上停留约20分钟，随后被内化；而PEG修饰的探针3则能在细胞表面实现长时间的比率荧光检测，荧光信号可持续120分钟。重要的是，探针3不仅能够选择性显示癌细胞中硫酸肝素的过表达情况，并在siRNA或化学抑制剂抑制硫酸肝素硫酸化后敏感地检测其消耗情况，还能在人血液样本中实现敏感且选择性的检测。
实验部分
实验所用化学品的来源详见补充信息。
活细胞表面HSPGs荧光探针的合成
在之前的研究中，我们开发了一种比率荧光探针（HS探针），该探针由分支肽和可见光激发的荧光团（PyCN）组成（图1）（Subedi, 2023）。该探针在活细胞中以纳摩尔级灵敏度检测到硫酸肝素，并在结合HSPGs时表现出强烈的比率荧光响应。然而，探针的快速内化限制了其在细胞表面持续监测硫酸肝素的效果。为了解决这一问题，我们开发了新一代探针。
结论
我们开发了一种结构新颖的、锚定在细胞表面的荧光探针，用于活细胞和人血液中硫酸肝素的选择性和定量检测。PEG修饰的探针在细胞表面具有较长的停留时间（>120分钟）和强烈的比率荧光响应，能够在生理相关条件下实现实时、非侵入性的硫酸肝素监测，具有纳摩尔级的灵敏度。这有助于精确量化硫酸肝素的表达和消耗情况，尤其是在酶抑制或siRNA作用后的变化。
CRediT作者贡献声明
李在善（Jae-Seon Lee）：撰写、审稿与编辑。
基肖尔·卡德卡（Kishor Khadka）：实验研究、数据管理。
苏米塔·苏贝迪（Sumita Subedi）：实验研究、数据管理。
黄贤贞（Hyun Jung Hwang）：实验研究、数据管理。
李根亨（Keun-Hyeung Lee）：撰写、审稿与编辑。
未引用参考文献
Anower-E-Khuda等, 2013; Bishop等, 2007; Bogacheva等, 2017; Bose和Banerjee, 2002; Brennan等, 2012; Cagno等, 2019; Chhabra等, 2021; Christianson和Belting, 2014; Esko和Lindahl, 2001; Esko等, 2011; Fan等, 2020; Gui等, 2019; Harris和Chess, 2003; Hayashida等, 2022; Hsu等, 2021; Jana和Kanvah, 2020; Jia等, 2021; Jun等, 2020; Jung等, 2016; Kobayashi等, 2010; Kreuger和Kjellén, 2012; Lee等, 2018; Lee等
利益冲突声明
? 作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了韩国国家研究基金会（National Research Foundation of Korea）的资助（项目编号：2023R1A2C2003673, NRF-2021R1A5A2031612）。
