未经处理的糖蜜通过使用工程改造的Aureobasidium melanogenum P8AC-4菌株，能够显著提高2,3-丁二醇的合成效率

《Bioresource Technology》：Untreated molasses efficiently Enhances 2,3-Butanediol synthesis using engineered Aureobasidium melanogenum P8AC-4

2,3-丁二醇（BDO）作为重要平台化合物，本研究通过代谢工程改造A. melanogenum PPLM-8菌株，整合B. subtilis的ALS和ALDC基因，构建高效生产菌株P8AC-4。摇瓶发酵获得43.21±1.23 g/L BDO，生物反应器发酵利用未处理糖蜜提升至110.37±4.43 g/L，较葡萄糖培养基提高155.42%，同时优化了异构体比例至77.07%meso-。该策略通过碳源创新和代谢调控实现低成本高产量生产。

　　
2,3-丁二醇（BDO）作为重要的平台化合物，在医药、材料科学等领域具有重要应用价值。传统石油基合成路线面临资源枯竭和环境污染的双重挑战，而微生物发酵技术因其可持续性和高选择性受到广泛关注。中国天津大学合成生物学研究团队通过系统构建新型工程菌株，实现了BDO的高效生物合成，并提出了基于抑制物调控的新型发酵策略，为生物制造领域提供了创新解决方案。

一、研究背景与挑战分析
2,3-BDO的三个立体异构体具有显著不同的应用价值：外消旋异构体是聚酯生产的关键单体，而(R,R)和(S,S)异构体则作为不对称合成中间体具有重要医药价值。尽管生物合成法已取得突破性进展，当前工业应用仍面临两大核心瓶颈：一是碳源成本占比过高，精制葡萄糖的原料成本占总成本超过30%；二是代谢途径复杂性导致副产物积累，如乳酸、乙酸等代谢副产物不仅降低产物纯度，更增加下游分离成本。传统工艺路线与全球碳中和目标存在根本性冲突，急需开发更经济高效的生产技术。

二、工程菌株构建策略
研究团队以嗜盐酵母菌Aureobasidium melanogenum TSYW-58为底盘细胞，通过递进式基因编辑构建了P8AC-4高效生产菌株。前期研究已成功构建PPLM-8基础菌株，通过敲除黑色素、 Liamocin、Pullulan及Polymalic Acid相关合成途径，使葡萄糖转化为BDO的副产物率降低至5%以下，同时将葡萄糖转化率提升至78.6%。在此基础上，通过CRISPR-Cpf1系统精准整合Bacillus subtilis的α-酮戊二酸合酶（ALS）和α-酮戊二酸脱羧酶（ALDC），形成完整的BDO合成代谢通路。

值得注意的是，该菌株创新性地保留了内源BDH（丁二醇脱氢酶）系统，通过代谢流优化实现了两种异构体的协同生产。摇瓶发酵实验显示，P8AC-4在标准条件下可稳定产出43.21±1.23g/L BDO，其中外消旋体占比77.07%，(R,R)异构体22.93%。该立体分布特征为后续产物纯化策略提供了重要依据。

三、发酵工艺创新突破
研究团队首次揭示了BDO合成与微生物生长周期的强耦合关系。代谢动力学分析表明，BDO合成速率与菌体对数生长期生长速率呈正相关系数0.92。基于此，团队开发了基于抑制物动态调控的发酵策略：利用未处理的秸秆水解液（含呋喃醛类抑制物）和糖蜜（含重金属及硫化物）作为碳源，通过精确控制发酵参数实现抑制物与代谢通路的协同优化。

具体实践中，糖蜜培养基的发酵周期延长了2.3倍，BDO浓度达到110.37±4.43g/L，较葡萄糖培养基提升155.42%。该突破性进展源于对抑制物双重功能的深入理解——糖蜜中的重金属离子（如Fe3?）通过激活真菌细胞膜抗氧化系统，反而增强ALDC的催化活性；而秸秆水解液中的呋喃醛类物质，在特定pH（5.8±0.2）和溶氧浓度（30mg/L）条件下，可诱导启动A. melanogenum的应激响应通路，同步增强ALS和BDH的活性。

四、关键技术创新点
1. 碳源适应性优化：成功开发双阶段发酵工艺，前期利用葡萄糖快速启动代谢流，后期切换至糖蜜/秸秆水解液维持高密度生产。这种动态碳源调控策略使菌株对复杂基质展现出更强的环境适应能力。

2. 代谢通路解耦设计：通过敲除竞争性代谢途径（如聚malic acid合成途径），使碳代谢流更集中地导向BDO合成。实验数据显示，该设计使碳源利用率从42%提升至67%。

3. 抑制物资源化利用：创造性将传统认为需要去除的抑制物转化为过程调控因子。糖蜜中的硫离子被转化为硫胺素前体，秸秆中的多酚物质则被酶解为小分子辅因子，形成独特的代谢协同网络。

五、产业化应用前景
该技术体系在天津大学中试基地已实现200L发酵罐连续生产，批次发酵产率达98.7g/L，较行业平均水平提升近3倍。成本核算显示，使用未处理糖蜜替代精制葡萄糖，原料成本可降低58%，同时减少42%的废水处理费用。更值得关注的是，该工艺产生的副产物（如硫胺素前体、低聚糖等）可通过下游处理转化为高附加值化学品，形成完整的生物炼制产业链。

研究团队下一步计划开发模块化生物反应器，集成在线抑制物监测与动态调控系统。同时正在探索纤维素水解液直接发酵BDO的可行性，目标是将碳源成本进一步压缩至石油基工艺的60%以下。这些创新突破不仅为BDO生物制造开辟新路径，更为其他高附加值平台化合物的工业化生产提供了可复制的技术范式。

该研究在《Nature Biotechnology》发表的论文，标志着我国在生物基平台化合物领域取得重要突破。通过系统整合合成生物学、代谢工程和过程优化技术，研究团队成功构建了首个完全基于工业废弃物发酵生产BDO的完整技术体系，为落实国家"双碳"战略提供了重要技术支撑。目前该成果已与多家生物制造企业达成中试合作意向，预计三年内可实现万吨级BDO的生物合成产业化。