机器学习技术实现了恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）环孢子体蛋白的新多表位设计，该设计旨在靶向三聚体L9抗体

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Machine learning enables de novo multiepitope design of Plasmodium falciparum circumsporozoite protein to target trimeric L9 antibody

机器学习驱动的结构导向多表位抗原设计管道MESODID被开发用于构建稳定疟原虫CSP血蛋白的三重minor repeat抗原，有效模拟L9抗体的同型相互作用。通过迭代优化（饱和突变、二硫键工程、能量筛选），成功设计出M-TIM抗原，其冷冻电镜结构（3.6?）显示三份量L9抗体与抗原结合，分子动力学模拟证实M-TIM较游离肽更稳定维持抗原构象。该技术为HIV-1包膜、SARS-CoV-2刺突等多表位疫苗开发提供通用方法。

　　
这项研究聚焦于通过机器学习驱动的结构导向蛋白设计，开发新型多表位疟疾疫苗抗原。研究团队针对疟原虫血孢子蛋白（PfCSP）的核心重复区域中的次要重复序列（NPNV）设计抗原，旨在通过结构优化增强与高效单克隆抗体L9的结合能力，同时模拟抗体之间的同型相互作用，这是L9在体内发挥保护作用的关键。

### 研究背景与核心挑战
疟疾仍是全球最致命的传染病之一，现有疫苗如RTS,S和R21虽能提供一定保护，但存在抗体应答质量不稳定、对变异株覆盖不足等问题。疫苗的抗原成分多采用血孢子蛋白的重复序列，但传统疫苗仅整合主要重复序列（NANP/NPNA），而次要重复序列（NPNV）因结构松散难以有效呈递。研究发现，针对NPNV的抗体L9具有更强的保护效力，其作用依赖于三个抗体分子通过同型相互作用形成稳定复合物。然而，如何通过蛋白设计稳定这三个NPNV表位并引导L9形成有效构象，成为研究的关键。

### 创新方法：MESODID管道的构建与迭代优化
研究团队开发了MESODID（多表位结构优化深度迭代设计）管道，这一系统化流程整合了深度学习预测与结构生物学验证，突破传统蛋白设计工具的局限。具体步骤包括：

1. **初始设计阶段**
利用RFdiffusion生成50,000种蛋白骨架，结合ProteinMPNN设计序列，确保三个NPNV表位在空间上合理分布。筛选标准基于预测结构的质量（pLDDT>85，Cα-RMSD<1?），最终确定19种候选设计进入实验室验证。

2. **多轮迭代优化**
MESODID引入三个关键优化模块：
- **饱和突变体筛选**：对非表位区域进行全密码子替换，保留最佳突变体（筛选率24.1%）。
- **二硫键工程**：通过比对PDB数据库中的天然二硫键模式，引入稳定化结构（筛选率11.6%）。
- **能量过滤与构象优化**：使用Rosetta进行固定骨架松弛，消除抗原与抗体结合时的空间冲突，最终保留Rosetta评分<-350的优化设计。

3. **结构验证与功能测试**
通过负染色电镜和单粒子质谱分析，确认最佳设计M-TIM（设计4）能稳定结合三个L9抗体，形成类似天然CSP复合物的结构。分子动力学模拟进一步证明，M-TIM的三次重复序列具有显著结构稳定性（RMSD<2?），而游离的NPNV多肽在模拟中呈现高度动态构象变化。

### 关键发现与科学意义
1. **M-TIM的结构特性**
M-TIM采用假β- barrels结构，中心α螺旋与三个NPNV表位形成稳定结合界面。其晶体结构显示，每个NPNV表位与L9的CDRL1（W32L）、CDRL3（Y94L）和CDRL3（R96L）等关键残基形成氢键与疏水作用，与天然CSP复合物（PDB:8EK1）的相互作用模式高度一致。

2. **同型相互作用的重要性**
通过比较M-TIM与L9_HOKO（敲除同型结合残基的抗体）的亲和力变化（EC50从53 ng/mL升至22 nM），证实抗体之间的同型相互作用对结合稳定性和保护效力至关重要。电镜显示三个L9抗体以对称方式包被M-TIM，形成与天然复合物类似的稳定构象。

3. **技术扩展性分析**
研究团队指出MESODID可拓展至其他重复表位疫苗设计，如HIV envelope（ gp120三聚体）、SARS-CoV-2刺突蛋白（RBD三聚体）和流感HA蛋白（FAB表位三聚体）。例如，针对HIV envelope的多表位设计可能突破传统单表位疫苗的广谱性局限。

### 疫苗开发的应用前景
1. **下一代CSP疫苗的升级**
现有疫苗（如RTS,S）包含19个主要重复序列（NANP/NPNA），但无法激活针对次要重复（NPNV）的抗体。M-TIM通过结构工程将三个NPNV表位整合到单一抗原，可能显著提升抗体亲和力与同型结合效率，从而增强免疫记忆。

2. **多价疫苗的协同效应**
实验表明M-TIM与CSP_5_3（天然CSP的5个重复序列）对L9的亲和力相当（8.1 vs 0.14 nM），但M-TIM的稳定性优势可能使其更适合与现有疫苗联用，形成"抗原+结构引导"的协同免疫策略。

3. **抗体发现平台的创新**
研究证实M-TIM可作为新型抗体筛选探针：通过免疫接种表达M-TIM的转基因小鼠，可从血清中分离出针对NPNV的高亲和力抗体，其开发效率较传统方法提升约3个数量级。

### 技术突破与理论贡献
1. **多表位蛋白设计的范式转变**
传统疫苗设计依赖随机多肽组合，MESODID通过机器学习预测与结构生物学验证的结合，首次实现三个松散重复序列的定向整合与构象稳定化。这一方法为解决HIV gp120、登革病毒D环蛋白等复杂多表位抗原设计提供了通用框架。

2. **动态构象稳定机制**
分子动力学模拟揭示，M-TIM的β-折叠结构通过四个关键残基（F27H、F28L、F96H、F100C）形成稳定疏水口袋，同时NPNV序列的刚性结构抑制了重复单元的构象漂移。这种"结构锚定"策略使抗原在溶液中保持更接近天然状态的构象，提高抗体结合概率。

3. **机器学习预测的可靠性验证**
研究通过实验数据与预测模型的对比，证实了ESMfold和AlphaFold 2在抗原结构预测中的可靠性（RMSD<1.5?）。特别值得注意的是，AlphaFold 3对复合物构象的预测存在偏差，这提示在抗体-抗原复合物设计中仍需依赖实验验证。

### 产业化挑战与未来方向
1. **表达纯化优化**
实验显示16/19的候选蛋白成功表达，但需进一步优化表达系统（如提高真核表达效率）和纯化工艺（如减少His标签对表位构象的影响）。

2. **递送系统的适配性**
M-TIM的分子量（23 kDa）和结构复杂性可能影响其通过现有疫苗递送系统（如Lipid Nanocarriers）的效率，需开发新型递送载体。

3. **临床前验证体系**
研究建议后续需建立标准化评估体系，包括：
- 同型抗体协同效应的体内验证（如Pf-3D7感染模型）
- 构象稳定性的长期观察（加速老化实验）
- 不同接种途径的效力比较（肌肉注射vs鼻喷雾）

### 总结
该研究通过整合机器学习预测、迭代结构优化和实验验证，成功构建了首个具有三个稳定NPNV表位的工程抗原M-TIM。其技术路径不仅解决了多表位蛋白设计的核心难题，更为HIV、新冠病毒等复杂抗原疫苗开发提供了可复制的方法论。未来需重点突破大规模生产、构象保持性优化及与现有疫苗的协同效应研究，这将为下一代广谱、长效的疟疾疫苗奠定基础。