综述：采用热响应性聚合物界面的创新生物分离技术

《Polymer Journal》：Innovative bioseparation technologies employing thermoresponsive polymer interfaces

本综述系统阐述了基于聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)的热响应性界面在生物分离领域的前沿应用。作者详述了通过原子转移自由基聚合(ATRP)等技术精准调控聚合物刷结构，开发出温度响应色谱、细胞分离柱、病毒载体纯化等创新平台。这些技术通过温度变化可逆调节界面亲疏水性，实现了抗体药物、干细胞、病毒载体(AAV2)和细胞外囊泡(外泌体)的高效分离，在治疗药物监测(TDM)和再生医学中展现出重要价值。该技术摒弃有机溶剂，为生物制药提供绿色解决方案。

　　

温度响应色谱

色谱技术凭借固定相与分析物间的相互作用成为生物分子分离的重要工具。基于PNIPAAm修饰固定相的新型色谱系统，通过改变柱温可逆调节固定相与分析物间的疏水相互作用：低温时PNIPAAm水合化减弱疏水作用保留时间缩短，高温时脱水增强作用延长保留时间。采用ATRP技术可制备PNIPAAm刷密度达0.133链/纳米2的硅胶微球，相比传统自由基聚合接枝量提升8倍以上。通过引入疏水单体BMA或离子单体DMAPAAm/AAc，还可构建温度响应混合模式色谱，实现对亲水性分析物和离子生物分子的高效分离。

治疗药物监测应用

采用PNIPAAm水凝胶修饰硅胶微球的HPLC色谱柱，仅通过调节柱温即可控制分析物保留行为，实现无有机溶剂的全水相流动相分离。该系统成功分离了苯妥英、卡马西平等10种药物与血清蛋白，血清蛋白因与PNIPAAm作用弱而快速洗脱，药物因疏水作用适度保留。二维色谱系统进一步优化了血清蛋白去除效率：初级柱采用接枝密度0.076链/纳米2的稀松PNIPAAm刷，可快速分离血清蛋白与药物；次级柱实现药物准确定量，为临床TDM提供新方案。

蛋白质纯化技术

温度响应离子交换色谱在生物制药纯化中表现突出。采用P(NIPAAm-co-DMAPAAm-co-tBAAm)刷修饰的色谱柱，通过静电与疏水作用协同调控，在37℃时酸性人血清 albumin(HSA，等电点4.7)被保留，中性γ-球蛋白直接洗脱；降温至10℃即可释放HSA。强酸性单体AMPS或强碱性单体APTAC的引入，可增强与碱性蛋白(如溶菌酶)的相互作用。嵌段共聚物刷PAPTA C-b-PNIPAAm相比无规共聚物与儿茶酚胺作用更强，实现了乳清蛋白中α-乳白蛋白与β-乳球蛋白的温度调控分离。

细胞分离创新策略

基于PNIPAAm共聚物刷修饰的玻璃基底，利用细胞黏附/脱附的温度差异性实现细胞分选。人骨骼肌成肌细胞(HSMM)与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)在PNIPAAm刷上呈现不同脱附动力学：20℃时HUVECs快速脱附，HSMM缓慢脱附。通过P(NIPAAm-co-BMA)刷的多步温度调控(37℃→10℃→20℃)，可依次分离正常人真皮成纤维细胞(NHDFs)与HUVECs。人骨髓源间充质干细胞(hbmMSCs)的分离采用P(NIPAAm-co-DMAPAAm-co-tBAAm)刷，其阳离子特性可特异性增强hbmMSCs黏附。

亲和配体增强分离

将细胞亲和肽/糖聚合物与温敏聚合物结合，可提升分离特异性。内皮细胞亲和肽REDV与温敏嵌段共聚物刷结合，在37℃时上层PNIPAAm收缩暴露REDV肽段，特异性捕获内皮细胞；20℃时聚合物伸展削弱亲和作用释放细胞。半乳糖修饰的糖聚合物PVLA可通过去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)特异性识别肝细胞，PVLA-b-PNIPAAm刷成功分离iPS细胞源肝细胞与未分化iPS细胞。此类技术为高纯度细胞制备提供新途径。

规模化分离平台

为解决平面基底表面积限制，开发了电纺丝制备的PNIPAAm修饰微纤维(直径20μm)，其三维结构显著增加细胞吸附容量，成功从脂肪源细胞混合物中分离脂肪源间充质干细胞(ADSCs)。采用聚合物共混(PVBC/PBMA)策略增强微纤维机械性能，实现NHDFs与HSMM细胞的温度控制分离。 syringe型分离柱填充PDMAPAAm-b-PNIPAAm刷修饰的大孔径硅胶微球(150-250μm)，通过温度调节静电/疏水作用，实现间充质干细胞的高活性回收。

病毒载体与外泌体纯化

基于PNIPAAm/PAMPS混合聚合物刷的色谱柱，利用PAMPS磺酸基团与AAV2病毒载体表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的相互作用，在40℃时PNIPAAm收缩暴露PAMPS实现病毒捕获，5℃时释放并保持病毒感染活性。外泌体分离采用肽段修饰的PNIPAAm嵌段共聚物刷，分子量22,000的PNIPAAm链段可通过伸展/收缩可逆调控亲和肽与外泌体的相互作用，实现SK-BR-3细胞源外泌体的温和高效分离。

这些技术通过精准的界面设计，将温度响应性与生物亲和性巧妙结合，为生物医药领域提供了绿色、高效且能保持生物活性的分离纯化新范式，在药物生产、基因治疗和再生医学中具有广阔应用前景。