综述：靶向蛋白降解嵌合体（PROTAC）技术的进化以克服抗菌素耐药性挑战

《npj Antimicrobials and Resistance》：Evolution of proteolysis-targeting chimeras (PROTAC) technology to overcome challenges of antimicrobial resistance

本综述系统阐述了PROTAC技术如何利用细胞固有的泛素-蛋白酶体系统等降解机制，通过双功能分子（PROTAC）选择性清除病原体关键蛋白，为应对日益严峻的抗菌素耐药性（AMR）危机提供了颠覆性策略。文章深入探讨了其在细菌（如结核分枝杆菌ClpC1-P1P2系统）、病毒（如流感病毒、HBV）中的应用，并展望了纳米颗粒、外泌体等新型递送系统在克服PROTAC自身挑战（如细胞渗透性差）方面的潜力。

　　

概述靶向蛋白降解技术

抗菌素耐药性（AMR）已被世界卫生组织列为全球十大健康威胁之一，传统抗生素的疗效下降和研发停滞使得寻找全新作用机制的抗菌策略迫在眉睫。靶向蛋白降解（TPD）技术，尤其是蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC），代表了一种超越传统抑制模式的革命性治疗范式。它不再满足于暂时阻断蛋白质的功能，而是利用细胞自身的蛋白质质量控制 machinery，直接对致病蛋白进行催化性的清除，从而为应对AMR提供了新的希望。

TPD策略的核心在于招募宿主的降解机器，如蛋白酶体或溶酶体，来消除病原蛋白。这种方法具有突变韧性和高效力等优势。除了经典的PROTAC，还涌现出分子胶（Molecular Glue）、特异性非遗传IAP依赖性蛋白擦除器（SNIPER）、自噬靶向嵌合体（AUTAC）、溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）等多种技术，极大地扩展了可成药靶点的空间。

PROTAC的结构与作用机制

PROTAC分子是异双功能的小分子单元，由三个关键部分通过共价连接构成：一个结合目标蛋白（POI）的配体、一个招募E3泛素连接酶的配体，以及连接两者的连接子（Linker）。其作用机制宛如“分子胶水”，将原本无关的POI和E3连接酶拉近，形成三元复合物。E3连接酶随后给POI贴上泛素“标签”，被标记的POI最终被26S蛋白酶体识别并降解成多肽片段。

连接子化学与三元复合物形成

连接子的设计和优化是PROTAC成功的关键。连接子的长度、刚性、极性和连接出口向量等属性，深刻影响着三元复合物的空间构象和形成动力学。研究表明，过短或过长的连接子都可能不利于降解效率。例如，针对BRD4的VHL导向PROTAC中，较短的烷基链连接子能促进更紧密的三元复合物形成，而过度柔性的聚乙二醇（PEG）链则会因熵负担而阻碍降解动力学。在BacPROTAC-1类似物的设计中，缩短的基于磷酸化精氨酸的连接子保持了降解效率，但改变其ClpC结合能力的变体则活性受损，这凸显了精确空间协调的必要性。“桥联PROTAC”（Bridged PROTAC）通过优化弹头与E3配体之间的几何结构，成功降解了此前难以成药的蛋白。

非经典的靶向降解剂

PROTAC技术自20世纪90年代末由Craig M. Crews教授团队提出以来，发展迅猛。除了经典的双功能PROTAC，还衍生出多种创新形式，例如基于适配体的RNA-PROTAC、前药型Pre-PROTAC、光控的AP-PROTAC、点击化学形成的CLIPTAC、基于纳米抗体的降解剂等。这些技术旨在解决PROTAC面临的细胞渗透性差、溶解性低、脱靶效应和钩状效应（Hook effect）等挑战。

PROTAC在感染性疾病中的应用

抗病毒PROTACs

在抗病毒领域，PROTAC展现出巨大潜力。针对乙型肝炎病毒（HBV）的X蛋白，研究者设计了包含寡聚化/不稳定性结构域和细胞穿透肽的PROTAC，能在HepG2细胞中快速降解不同形式的X蛋白，为研究HBV感染和预防肝细胞癌提供了工具。另一项研究则发现了基于五环三萜的PROTAC V3，它能有效降解流感病毒血凝素（HA），中位浓度为1.44μM，保护小鼠免受病毒毒性，并对甲型流感病毒显示出广谱且显著的效力。

细菌中的降解系统：ClpCP:McsB

在细菌中，尤其是革兰氏阳性菌，存在一个与真核生物泛素-蛋白酶体系统功能类似的Caseinolytic蛋白酶（ClpCP:McsB）降解网络。McsB作为一种精氨酸激酶，能磷酸化底物蛋白的精氨酸残基，产生的磷酸化精氨酸（pArg）标签类似于泛素化标签。pArg标记的蛋白被ClpC（一种ATP依赖的解折叠酶）识别并解折叠，随后转运至由ClpP组成的蛋白酶“笼子”中进行降解。

在结核分枝杆菌（Mtb）中，ClpC1-P1P2蛋白酶复合物是一个关键的药物靶点。ClpC1作为ATP酶，与ClpP1和ClpP2蛋白酶共同形成一个降解腔室，对细菌在压力条件下的蛋白质稳态至关重要。新发现的靶向ClpC1P1P2的抗生素显示出强大的抗Mtb活性。

BacPROTACs：细菌靶向降解

BacPROTAC的概念将PROTAC技术成功应用于细菌系统，主要针对分枝杆菌。一个里程碑式的发现是抗结核一线药物吡嗪酰胺（PZA）实际上是一种单价的“类PROTAC”降解剂。其活性形式吡嗪酸（POA）与靶点PanD结合后，并非简单抑制，而是诱导PanD发生构象变化，暴露出降解标签，进而被细菌的ClpC1-ClpP系统降解。这一机制与抗癌药物氟维司群（Fulvestrant）作为选择性雌激素受体降解剂（SERD）的作用模式惊人地相似。

研究人员进一步设计了真正的双功能BacPROTACs。例如，BacPROTAC-1将pArg支架与生物素（结合单体链霉亲和素mSA）连接，能有效招募mSA至ClpCNTD并被ClpCP降解。通过将环孢霉素A（cyclomarin A）的衍生物sCym-1或dCymM与靶向人源蛋白BRDTBD1的配体JQ1连接，成功构建了BacPROTAC-2至5系列，证明了该技术在细菌内实现靶向蛋白降解（TPD）的可行性和灵活性。

同源BacPROTACs：机制与变体

同源BacPROTACs（HBP）是一类二聚体降解剂，由两个去氧环孢霉素（dCym）头基通过连接子构成。例如HBP6和HBP7，它们能同时靶向ClpC1及其“守护者”ClpC2，诱导它们发生“自我降解”。表面等离子共振（SPR）证实其对ClpC1-NTD具有亚纳摩尔级的高亲和力。在耻垢分枝杆菌中，HBP能有效降解内源性的ClpC1和ClpC2，破坏细菌的蛋白质质量控制（PQC）系统，对病原性Mtb表现出强大的杀菌活性，甚至对耐药菌株也有效。这种双靶点降解策略能够克服细菌通过上调ClpC2/ClpC3产生的防御机制，为抗生素开发提供了新思路。

将BacPROTACs扩展至革兰阴性优先病原体

目前BacPROTAC的研究主要集中在分枝杆菌等革兰氏阳性菌。将其拓展至ESKAPE病原体中的革兰阴性菌（如肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌）是未来的重要方向，但也面临巨大挑战。这些挑战包括其不通透的外膜、活跃的外排泵以及缺乏特征明确的细胞内降解途径。未来可能需要探索利用革兰阴性菌自身的ClpXP或Lon蛋白酶系统作为降解轴心。同时，需要开发新的递送方法，如工程化的脂质纳米颗粒、肽模拟物或抗生素偶联的PROTAC，以帮助大分子双功能化合物穿越外膜。

克服PROTAC递送挑战的创新技术发展

蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）疫苗技术

研究者利用PROTAC概念开发了一种新型病毒减毒疫苗平台。以流感病毒为例，通过将病毒的M1蛋白与一个蛋白酶体靶向结构域（PTD）通过烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切割位点（TEVcs）连接，构建了M1-PTD病毒。这种病毒只能在表达TEV蛋白酶的工程细胞中有效复制，而在正常细胞中，PTD会引导M1蛋白被宿主蛋白酶体降解，从而使得病毒被显著减毒。动物实验表明，M1-PTD疫苗安全性好，能诱导比传统疫苗更强、更广泛的免疫反应，提供对同源和异源病毒攻击的完全保护。类似策略也被探索用于开发HIV疫苗，通过将合成长肽（SLP）抗原与E3连接酶配体连接，并封装在纳米颗粒中，以增强抗原的交叉呈递和细胞免疫应答。

纳米技术革命性的PROTAC递送

纳米颗粒（如脂质体、聚合物纳米粒等）为改善PROTAC的成药性提供了强大工具。它们可以保护PROTAC免于降解，提高其溶解度和稳定性，实现组织特异性积累和可控释放。针对细胞内病原体（如Mtb），表面功能化的纳米颗粒可以增强被细菌或感染巨噬细胞的摄取。尽管在克服免疫清除、胞质进入等方面仍存在挑战，但纳米递送系统为PROTACs在抗感染治疗中的应用带来了曙光。

表面受体靶向PROTACs

研究人员以抗流感药物奥司他韦为基础，将其与不同的E3连接酶配体（如VHL）通过多种连接子连接，设计了一系列奥司他韦基PROTACs。其中，化合物8e对H1N1病毒及其奥司他韦耐药株（H274Y）均显示出良好的抗病毒活性。机制研究表明，8e能通过泛素-蛋白酶体途径剂量依赖性地降解神经氨酸酶（NA）蛋白。

外泌体介导的PROTACs递送

外泌体是细胞分泌的天然纳米级囊泡，具有优异的生物相容性和靶向性。利用外泌体作为载体递送PROTACs，可以改善其生物利用度，并实现精准的细胞靶向。这一策略尤其适用于像HIV这样的病毒性疾病，外泌体能够穿透免疫豁免部位，靶向潜伏的病毒储存库，为清除病毒提供了新可能。

宿主蛋白靶向PROTAC

除了直接靶向病原体蛋白，靶向宿主中病原体复制所必需的因子是另一种广谱抗病毒策略。研究人员发现消炎痛（INM）具有抗SARS-CoV-2活性，其作用与抑制宿主蛋白mPGES-2有关。他们将INM与VHL配体连接，合成了INM衍生的PROTACs。其中，化合物3和5显示出比INM本身强4.5倍的抗病毒效力，并对其他人冠状病毒（HCoV-OC43和HCoV-229E）有活性，为开发广谱抗冠状病毒药物提供了概念验证。

挑战与未来展望

BacPROTACs和更广泛的抗感染PROTAC技术虽然前景广阔，但仍面临诸多挑战，包括分子量大导致的透膜性差、潜在的脱靶效应、以及针对革兰阴性菌的递送难题。未来的研究需要集中于优化连接子化学、发现新的细菌E3样招募因子、开发更高效的递送系统（如纳米技术、外泌体、病毒载体等）。同时，将PROTAC与其他治疗模式（如抗生素、免疫调节剂）联用，以及探索分子胶等更简单的降解策略，也是重要的方向。随着这些技术和策略的不断成熟，PROTAC技术有望成为对抗AMR的强大武器，引领精准抗菌治疗的新时代。