可编程Argonaute介导的cfDNA单核苷酸变异测序技术实现多癌种早期检测

《Nature Communications》：Programmable Argonaute-mediated single-nucleotide variant sequencing of cell-free DNA for multi-cancer early detection

本文报道了一种新型的酶切引导单核苷酸变异测序（EC-SNV-Seq）技术，通过整合Argonaute介导的特异性切割和茎环DNA引发的级联PCR扩增，实现了对循环肿瘤DNA（ctDNA）中低频突变（灵敏度达0.01% VAF）的高灵敏检测，为多癌种早期筛查提供了简单、经济且高效的新方案。

　　

癌症是全球第二大死因，世界卫生组织数据显示2020年约有1000万人因癌症死亡。早期发现是改善患者预后的关键，而液体活检（liquid biopsy）作为一种非侵入性检测手段，通过分析血液中的循环肿瘤DNA（ctDNA），为癌症的早期检测、治疗监测和个性化治疗提供了动态信息。然而，血液中ctDNA浓度极低，且混杂大量正常DNA，使得检测变得异常困难。传统的下一代测序（NGS）和微滴式数字PCR（ddPCR）等技术各有局限：NGS虽能全面分析突变，但需要高测序深度，成本高昂；ddPCR灵敏度高，但难以同时检测多种突变。因此，开发一种简单、经济、高效的高灵敏度cfDNA突变检测方法成为当务之急。

近日，发表在《Nature Communications》上的一项研究提出了一种名为"酶切引导单核苷酸变异测序"（Enzymatic Cleavage-directed Single Nucleotide Variant Sequencing, EC-SNV-Seq）的新技术。该技术通过将Argonaute介导的特异性切割与茎环DNA（stem-loop DNA）引发的级联PCR（cascade-PCR）信号放大相结合，实现了对cfDNA中单核苷酸变异（single-nucleotide variant, SNV）的高灵敏度、高特异性检测，为多癌种早期检测提供了新工具。

本研究主要采用了以下关键技术方法：1）利用嗜热Argonaute（TtAgo）蛋白/向导DNA（guide DNA）复合物对预扩增后的cfDNA进行突变等位基因特异性切割；2）开发茎环DNA和间隔寡核苷酸（spacer oligo）系统，特异性识别切割产物并启动级联PCR扩增；3）通过TaqMan实时荧光定量PCR进行信号读取；4）使用临床血浆样本（来自癌症患者和健康捐赠者）和细胞系cfDNA参考标准进行方法验证；5）与ddPCR进行性能对比评估。

EC-SNV-Seq检测技术的开发

研究人员首先开发了EC-SNV-Seq检测技术，该技术包含三个主要步骤：cfDNA的预扩增、TtAgo介导的突变等位基因特异性切割，以及茎环DNA引发的级联PCR信号放大。他们发现，与化脓性链球菌Argonaute（PfAgo）相比，TtAgo在区分单核苷酸变异方面表现更优。通过优化间隔寡核苷酸的长度和修饰（如添加四个未修饰核苷酸），有效降低了野生型DNA的背景噪音。该技术对合成核苷酸和NSCLC ctDNA参考标准的检测灵敏度达到0.01%的变异等位基因频率（VAF），并且在54°C至64°C的退火温度范围内表现稳健。

可编程的多重DNA突变检测

研究证实EC-SNV-Seq具备多重检测能力。他们使用包含六种合成核苷酸变异/野生型对（各1μM，1% VAF）的混合物，以及包含四种突变（0.8% EGFR^L858R、0.8% EGFR^E746_A750、0.5% KRAS^G12V和1% KRAS^G12D）的NSCLC cfDNA参考标准，成功实现了4重突变检测和分类。在六名携带不同突变（PIK3CA^E545K、EGFR^L858R、EGFR^E746_A750、KRAS^G12A、KRAS^G12V和KRAS^G12D）的癌症患者混合血浆样本中，EC-SNV-Seq也成功进行了多重突变分析，尽管由于血浆混合导致EGFR^L858R信号稀释而未检测到。这表明该技术在癌症诊断中具有精确突变分析的潜力。

EC-SNV-Seq检测的单核苷酸变异测序

研究展示了EC-SNV-Seq区分KRAS基因第12密码子单核苷酸错义置换（c.35 G>T对应G12V，G>A对应G12D，G>C对应G12A）的能力。凝胶电泳证实了TtAgo/向导DNA复合物对每种错义置换的特异性切割。使用不同VAF（0.1%至100%）的合成核苷酸样本和含有0.1% KRAS^G12D及0.05% KRAS^G12V的稀释cfDNA参考标准，EC-SNV-Seq对单突变核苷酸错义置换的识别检测限（LoD）达到0.1%。在15名癌症患者和15名健康个体的临床样本测试中，EC-SNV-Seq准确预测了14名癌症患者的突变核苷酸基因型和14份野生型样本，与组织活检结果高度一致，尽管在区分高度相似的KRAS^G12A和KRAS^G12V时出现个别误分类。

基于EC-SNV-Seq分析的多癌种早期检测

研究人员将EC-SNV-Seq应用于多癌种早期检测，并与ddPCR方法进行比较。在35份临床血浆样本（20份癌症患者，15份健康人）中，EC-SNV-Seq正确识别出20份癌症样本中的19份，灵敏度达95%，特异性为93.3%，总体准确率为94.29%。其受试者工作特征曲线下面积（AUC）为0.977，与ddPCR（AUC=0.975）相当。这表明EC-SNV-Seq在检测cfDNA低频突变方面具有成为简单、经济、灵敏诊断工具的潜力。

基于混合血浆样本的人群规模多癌种早期筛查

为评估EC-SNV-Seq在人群规模筛查中的适用性，研究将60名癌症患者和10名健康捐赠者的血浆样本（每人50μL）分组混合。EC-SNV-Seq成功在多个参与者组中识别出特定突变，例如在第1组5号参与者中检出PIK3CA^E545K，在第4组31号参与者及第6组51号和58号参与者中检出KRAS^G12D等。与非癌症组的阴性结果相比，EC-SNV-Seq在70份样本的突变筛查中灵敏度为66.67%，特异性为100%，精确度为100%，总体准确度为95.71%，AUC为0.8645，显示出其在资源有限环境下进行人群规模突变分析和多癌种早期筛查的潜力。

综上所述，EC-SNV-Seq技术通过结合TtAgo的高特异性切割能力和茎环DNA引发的级联PCR信号放大，实现了对cfDNA中低频单核苷酸变异的高灵敏度（0.01% VAF）、高特异性检测，且无需复杂的突变富集步骤。该技术具备单核苷酸分辨率、多重检测能力、样本需求量小（低至50μL血浆）、检测速度快（约2小时）以及成本低廉（每反应约3.32美元）等优势。其在临床样本验证中表现出的高性能，以及与ddPCR相当的高诊断准确性，标志着其在非侵入性多癌种早期检测、治疗监测和个性化医疗策略制定方面具有重大应用前景。未来，该技术有望进一步扩展至mRNA、miRNA等核酸生物标志物的检测，并整合更多关键突变，如KRAS^G12C、BRAF^V600E等，以增强其临床实用性。尽管在区分高度相似的核苷酸置换时存在挑战，但EC-SNV-Seq为推进癌症诊断护理标准提供了一种简单、可扩展且高效的解决方案。