线粒体心磷脂代谢关键酶Tafazzin缺陷通过损害血管平滑肌细胞功能促进动脉粥样硬化

《Nature Communications》：Defective vascular smooth muscle cell tafazzin impairs mitochondrial function and promotes atherosclerosis in preclinical models

本研究针对动脉粥样硬化斑块中血管平滑肌细胞(VSMC)线粒体功能异常的机制展开探索。研究人员发现斑块VSMC中线粒体心磷脂代谢关键酶Tafazzin表达降低，其受microRNA-125a-5p调控并通过NF-κB通路被氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导。实验证实Tafazzin缺陷导致心磷脂含量下降、线粒体呼吸功能受损、细胞凋亡增加和动脉粥样硬化进展，而Tafazzin过表达或小肽SS-31处理可改善线粒体功能并增强斑块稳定性，为动脉粥样硬化治疗提供了新靶点。

　　

在心血管疾病领域，动脉粥样硬化始终是全球范围内导致死亡的首要原因。这种疾病以动脉内纤维脂肪斑块形成为特征，斑块破裂会引发血栓形成、血管闭塞，进而导致心肌梗死和中风等严重临床后果。尽管对其病理机制已有深入认识，但动脉粥样硬化的确切发病机制仍有待完全阐明，特别是斑块稳定性与细胞代谢异常之间的关联。

血管平滑肌细胞(VSMC)在动脉粥样硬化斑块中表现出显著的表型可塑性，并产生构成保护性斑块纤维帽的细胞外基质。既往研究发现，斑块帽和斑块来源的VSMCs均显示线粒体呼吸功能下降，然而是什么破坏了VSMC在动脉粥样硬化中的线粒体功能，以及VSMC线粒体呼吸功能受损的后果仍不清楚。

线粒体作为细胞的能量工厂，其功能高度依赖于结构的完整性。线粒体内膜是呼吸链和ATP合酶的位置，两者共同利用克雷布斯循环的底物生成ATP，同时产生活性氧(ROS)作为副产品。心磷脂(CL)是线粒体内膜的重要组成部分，能稳定蛋白-脂质相互作用并缓解由蛋白拥挤引起的膜应力。心磷脂首先以未成熟形式合成，然后脱酰基化为单溶血心磷脂(MLCL)，随后由Tafazzin（一种核编码的转酰基酶）再酰基化为成熟的心磷脂。

成熟的心磷脂随后可执行多种功能，包括稳定呼吸超复合体和调节细胞色素C的释放从而影响细胞凋亡。TAFAZZIN基因突变可引起Barth综合征，其特征为心肌病、骨骼肌肌病和生长受损。然而，tafazzin是否参与动脉粥样硬化的发病机制尚不清楚。

剑桥大学研究团队在《Nature Communications》发表的最新研究，首次揭示了tafazzin在动脉粥样硬化发生发展中的关键作用。他们发现动脉粥样硬化斑块及其VSMC中tafazzin表达显著降低，这一现象与microRNA-125a-5p表达上调密切相关。研究人员通过一系列精巧的实验证明，氧化低密度脂蛋白(oxLDL)通过激活NF-κB信号通路上调miR-125a-5p，进而抑制tafazzin表达，导致VSMC线粒体功能受损、细胞凋亡增加，最终促进动脉粥样硬化进展。

研究的关键技术方法包括：利用人类动脉粥样硬化斑块和正常主动脉组织进行组织学分析和分子生物学检测；建立VSMC特异性表达野生型Taz或功能突变型TazH69Q的转基因小鼠模型；通过Seahorse细胞能量代谢分析系统评估线粒体呼吸功能；采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术定量心磷脂含量；使用免疫荧光、Western blot、荧光原位杂交等技术进行蛋白和基因表达分析。

人类斑块和VSMC显示tafazzin表达降低

研究人员首先检测了人动脉粥样硬化斑块与正常主动脉组织中TAFAZZIN的mRNA表达。发现与正常主动脉组织相比，人斑块中TAFAZZIN mRNA表达显著降低。蛋白质印迹分析证实斑块中tafazzin蛋白表达减少，而柠檬酸合酶（线粒体总质量的指标）蛋白水平无变化。免疫荧光分析显示，正常主动脉组织中90.5±1.6%的SMA阳性细胞表达tafazzin，斑块中膜SMA阳性细胞的表达情况相似。然而，斑块内膜SMA阳性细胞中只有7.0±4.3%表达tafazzin。

对来自正常主动脉和斑块的VSMC进行培养后发现，与组织样本相似，斑块来源的VSMC中TAFAZZIN mRNA表达降低。结合已发表的单细胞RNAseq数据也显示，TAFAZZIN在斑块VSMC中表达较低，且显著低于巨噬细胞和内皮细胞。

MicroRNA-125a-5p调控tafazzin表达

为探究tafazzin表达降低的机制，研究人员检测了与动脉粥样硬化相关的可能上游调节因子。TargetScan miRNA数据库鉴定TAFAZZIN为microRNA-125a-5p(miR-125a-5p)的潜在靶标，推测结合位点位于3'UTR区域内。

研究发现miR-125a-5p在斑块中的表达增加。双荧光素酶报告实验证实，miR-125a-5p可直接与TAFAZZIN的3'UTR结合并抑制其表达。在VSMC中转染miR-125a-5p模拟物可降低tafazzin mRNA和蛋白丰度，而不影响柠檬酸合酶蛋白丰度，表明这是针对tafazzin的特异性调控而非全局性线粒体减少。

氧化LDL通过NF-κB途径上调microRNA-125a-5p

研究人员进一步探究了调控miR-125a-5p表达的因素。发现oxLDL可增加miR-125a-5p表达并降低tafazzin mRNA和蛋白丰度，而这种效应可被NF-κB抑制剂Bay 11-7082所阻断。机制上，oxLDL增加了NF-κB与其共识DNA基序的结合，增加了NF-κB磷酸化和miR-125a-5p表达。抑制NF-κB活化可阻断oxLDL诱导的miR-125a-5p增加和tafazzin减少。

功能上，转染miR-125a-5p模拟物或oxLDL处理的VSMC显示最大耗氧率降低，细胞增殖减少，凋亡增加。

Tafazzin是VSMC心磷脂含量和线粒体功能的重要决定因素

为研究tafazzin缺失在VSMC中的功能后果，研究人员进行了siRNA介导的基因沉默，并利用慢病毒介导的基因转移稳定表达野生型tafazzin(Taz)或催化位点组氨酸至谷氨酰胺突变的tafazzin(TazH69Q)。

结果显示，TAFAZZIN沉默或TazH69Q表达降低了心磷脂含量，而Taz过表达则增加了心磷脂含量。线粒体呼吸功能检测发现，TAFAZZIN沉默细胞和过表达TazH69Q的VSMC最大耗氧率降低，且伴随ATP/ADP比率降低。相反，过表达野生型tafazzin的VSMC显示耗氧率增加，但ATP/ADP比率无变化。

TAFAZZIN沉默和过表达TazH69Q的VSMC显示MitoSOX荧光增加，表明线粒体ROS升高。细胞功能上，TAFAZZIN沉默的VSMC显示EdU掺入减少，而Taz过表达的VSMC显示细胞死亡减少。在叔丁基过氧化氢处理诱导氧化应激时，TAFAZZIN沉默和TazH69Q过表达的VSMC均显示细胞死亡增加，而Taz过表达的VSMC仍显示对细胞死亡的保护作用。

VSMC特异性Taz和TazH69Q小鼠的特征

为研究内源性VSMC tafazzin减少对动脉粥样硬化的功能后果，研究人员生成了转基因小鼠模型，分别表达VSMC特异性的Taz或TazH69Q功能突变体。

VSMC来自Sm22a-Taz小鼠显示复合物I亚基丰度增加，而来自Sm22a-TazH69Q小鼠的VSMC显示复合物I亚基丰度降低。线粒体功能上，Taz VSMC显示基础耗氧率、最大耗氧率和ATP/ADP比率增加，线粒体ROS减少。相反，来自Sm22a-TazH69Q小鼠的VSMC显示基础和最大耗氧率降低，ATP/ADP比率降低和线粒体ROS增加。

VSMC tafazzin对动脉粥样硬化发生和细胞凋亡有重要影响

为研究内源性VSMC tafazzin减少对动脉粥样硬化的功能后果，表达VSMC限制性TAFAZZIN或TazH69Q的小鼠与Apoe^-/-小鼠杂交。

结果显示，Sm22a-Taz/Apoe^-/-小鼠与对照Apoe^-/-小鼠相比斑块面积无变化，但纤维帽面积增加，坏死核心区域减少，SMA阳性面积增加。相反，SM22a-TazH69Q/Apoe^-/-小鼠在降主动脉和主动脉根部的斑块面积均增加。这些小鼠还显示斑块易损性特征增加，包括坏死核心增加和纤维帽面积减少，SMA阳性面积减少和Mac3阳性（巨噬细胞标记）面积增加。

进一步检查发现，Sm22a-Taz/Apoe^-/-小鼠显示经历凋亡的VSMC百分比减少，而Sm22a-TazH69Q/Apoe^-/-小鼠显示VSMC凋亡增加。细胞增殖评估显示，Sm22a-Taz/Apoe^-/-小鼠与野生型Apoe^-/-小鼠相比细胞增殖增加，而Sm22a-TazH69Q/Apoe^-/-小鼠无变化。

SS-31治疗改善线粒体功能并减少细胞凋亡

研究表明，人动脉粥样硬化斑块VSMC中tafazzin表达降低，可能是由oxLDL诱导的miR-125a-5p上调所致。VSMC tafazzin受损会降低CL含量，促进线粒体功能障碍、细胞凋亡和动脉粥样硬化。因此，增强tafazzin可能对斑块发展和稳定性产生有益影响。

研究人员测试了小肽SS-31（据报道可结合并稳定心磷脂）的效果。发现SS-31可适度但显著增加Sm22a-TazH69Q VSMC的最大耗氧率。SS-31治疗还减少了叔丁基过氧化氢处理后Sm22a-TazH69Q VSMC的线粒体ROS和细胞凋亡。

研究结论与意义

本研究首次系统地揭示了tafazzin在动脉粥样硬化发生发展中的关键作用及调控机制。研究发现动脉粥样硬化斑块VSMC中tafazzin表达降低与miR-125a-5p上调密切相关，后者受oxLDL通过NF-κB信号通路诱导。Tafazzin缺陷导致心磷脂含量下降、线粒体呼吸功能受损、ATP生成减少、ROS增加，最终促进VSMC凋亡和动脉粥样硬化进展。

值得注意的是，研究人员构建的VSMC特异性表达野生型Taz或功能突变型TazH69Q的转基因小鼠模型，为直接验证tafazzin功能提供了有力工具。实验结果表明，增强VSMC tafazzin表达可改善线粒体功能、减少细胞凋亡并增加斑块稳定性特征，而表达功能缺陷的TazH69Q则促进动脉粥样硬化发展和斑块易损性。

特别有意义的是，小肽SS-31能够部分挽救tafazzin缺陷VSMC的线粒体功能异常，减少ROS产生和细胞凋亡，这为动脉粥样硬化的治疗提供了新的潜在策略。考虑到目前尚无直接靶向tafazzin的药物，SS-31的线粒体保护作用尤为引人关注。

该研究不仅阐明了动脉粥样硬化中线粒体功能异常的新机制，而且提出了通过调节tafazzin-心磷脂轴改善VSMC功能和治疗动脉粥样硬化的新思路。针对这一通路的干预策略，可能为未来动脉粥样硬化治疗开辟新的方向。