冠状病毒HKU5物种特异性ACE2识别的分子机制与跨种传播风险分析

《Nature Communications》：Molecular insights into species-specific ACE2 recognition of coronavirus HKU5

本研究针对β-冠状病毒HKU5的宿主适应性机制，通过冷冻电镜结构解析揭示了其刺突蛋白闭合构象中脂肪酸结合对构象稳定的作用，并首次阐明了HKU5受体结合域与蝙蝠ACE2的独特互作模式。研究发现HKU5可利用多种物种（包括鸟类）的ACE2受体，通过假病毒入侵和细胞融合实验验证了其跨种传播潜力，为冠状病毒预警提供了关键分子依据。

　　

冠状病毒（CoVs）作为重要的人畜共患病原体，其跨物种传播能力一直备受关注。从SARS-CoV、MERS-CoV到SARS-CoV-2，冠状病毒的多次暴发凸显了动物宿主（尤其是蝙蝠）作为病毒库的潜在风险。蝙蝠源性β-冠状病毒HKU5属于Merbecovirus亚属，与MERS-CoV亲缘关系密切，但其分子机制研究相对滞后。近年研究发现HKU5能够利用多种物种的血管紧张素转换酶2（ACE2）作为细胞入侵受体，包括日本家蝠（Pipistrellus abramus）、人类和貂等，这提示其潜在的跨种传播风险。然而，HKU5刺突蛋白（S蛋白）的构象调控机制及其与ACE2互作的结构基础尚不明确，阻碍了对其宿主适应性的深入理解。

为揭示HKU5的分子特性，研究团队通过冷冻电镜技术解析了HKU5 S蛋白的闭合构象结构，发现每个原体结合两个脂肪酸分子（油酸和棕榈酸），这些分子通过稳定S蛋白的“向下”构象可能延缓宿主细胞入侵或辅助免疫逃逸。进一步通过解析HKU5受体结合域（RBD）与蝙蝠ACE2蛋白酶结构域（PaPD）的复合物结构，发现其结合模式不同于SARS-CoV-2等其他ACE2利用型冠状病毒，涉及三个关键相互作用区域（Patch 1-3），其中RBD的β5-β8片层和α4螺旋与PaPD的α1-α3螺旋、β-发夹等结构域形成独特界面。

研究采用冷冻电镜结构解析、生物层干涉技术（BLI）、假病毒入侵实验、细胞-细胞融合 assay 及三分裂荧光系统等关键技术，结合进化分析，系统评估了HKU5的受体结合特性和跨种传播潜力。实验所用HKU5 S蛋白和ACE2蛋白酶结构域来源于蝙蝠（Pipistrellus abramus）、人类（Homo sapiens）及鸟类（Pitta sordida）等物种，通过HEK293F细胞表达纯化获得。

Structure of HKU5 S protein in the closed conformation

研究发现HKU5 S蛋白三聚体中所有RBD均处于“向下”状态，形成闭合构象。

质谱分析证实S蛋白结合油酸（C₁₈H₃₂O₂）和棕榈酸（C₁₆H₃₄O₂），分别位于原体间界面（Pocket 1）和RBD内部（Pocket 2）。突变实验显示脂肪酸结合虽稳定闭合构象，但对ACE2介导的入侵非必需。

Interaction of HKU5 RBD with bat ACE2

HKU5 RBD通过紧凑的超二级结构与PaPD形成1107 ?2的结合界面，关键残基如RBD的K519与PaPD的E37等通过氢键和盐桥稳定互作。

与SARS-CoV-2等病毒相比，HKU5的ACE2结合位点位于PaPD表面不同区域，体现了其独特的进化路径。

Evolutionary dynamics of HKU5 RBD

对NCBI数据库中HKU5亚支的分析显示，RBD核心区域高度保守，但受体结合模体（RBM）存在超过30个变异位点。BLI实验表明不同亚支（如HKU5-3、GD2013）与PaPD结合亲和力相近（K_D≈20-35 nM），提示自然变异对受体结合影响有限。

Cross-species transmission risk analysis of HKU5

通过突变ACE2关键界面残基（如PaPD的R328A导致结合强度降低50%），发现327WRD329和352KND354基序在鸟类ACE2（如Pitta sordida）中高度保守。

假病毒入侵和细胞融合实验证实表达Pitta sordida ACE2的细胞可支持HKU5入侵，尽管其结合亲和力（K_D=122.9 nM）低于蝙蝠ACE2。结构分析显示鸟类ACE2的糖基化模式差异和界面残基变异（如E325替代P324）导致结合模式微调。

本研究揭示了HKU5通过脂肪酸稳定闭合构象、利用独特ACE2结合界面的分子机制，并首次发现其可劫持鸟类ACE2实现跨类传播。这挑战了β-冠状病毒仅感染哺乳类的传统认知，强调了监测HKU5及其变种人畜共患风险的必要性。研究成果为理解冠状病毒宿主适应性提供了结构基础，对前瞻性疫苗设计和跨物种传播预警具有重要科学价值。