人T细胞白血病病毒衣壳蛋白：一个未被发掘的潜在药物靶点的高分辨率结构解析

《Nature Communications》：The Human T-cell Leukemia Virus capsid protein is a potential drug target

本文针对尚无有效治疗手段的人T细胞白血病病毒1型（HTLV-1），首次解析其衣壳蛋白（CA）高分辨率晶体结构，鉴定出关键的晶格界面和独特的配体结合口袋。研究发现该口袋对病毒 infectivity 至关重要，为开发长效暴露前预防药物（如 lenacapavir 类似物）提供了结构基础，填补了HTLV-1基础病毒学研究空白。

　　

人T细胞白血病病毒1型（HTLV-1）自1979年被发现以来，一直是人类健康的重要威胁。作为首个被确认可导致人类疾病的反转录病毒，HTLV-1感染约10%的携带者会发展为侵袭性致死性恶性肿瘤——成人T细胞白血病（ATL），和/或进行性神经系统炎症性疾病——HTLV-1相关脊髓病/热带痉挛性截瘫（HAM/TSP）。后者临床表现为肌肉僵硬、无力、肠道和膀胱功能障碍以及性功能障碍等致残性症状。此外，携带者还可能出现其他相关炎症性疾病，包括肺部疾病、支气管扩张、葡萄膜炎和皮炎等。HTLV-1遍布全球，在每个有人居住的大陆都有流行区，已被分为7个亚型（A至G）。其中，亚型A（又称世界性毒株）遍布全球，尤其在日本流行，估计已感染110万人；亚型B、D、E、F和G主要局限于非洲；而亚型C（又称澳大利亚/美拉尼西亚亚型）发现于斐济/所罗门群岛、巴布亚新几内亚和澳大利亚中部的原住民社区。事实上，这些社区拥有世界上最高的HTLV-1感染率，近期研究表明高达40%的成年人口病毒检测呈阳性。

与HTLV-1形成鲜明对比的是，另一种能导致人类疾病的反转录病毒——人类免疫缺陷病毒（HIV），在过去的几十年里，其治疗取得了巨大成功。针对HIV/AIDS的成功治疗积累了丰富的抗病毒药物。相比之下，目前对HTLV-1尚无有效的抗病毒治疗方法，出现症状的患者预后仍然很差。某些最初为治疗HIV/AIDS而开发的抗病毒药物（如核苷类逆转录酶抑制剂替诺福韦和整合酶链转移抑制剂多替拉韦）可以在体外阻止HTLV-1的传播，表明临床研究应考虑其作为暴露前预防（PrEP）的有效性。蛋白酶抑制剂显示出一定的活性，但通常效力较低，且作用于病毒生命周期的晚期阶段。尽管尚未进行临床研究，但这些研究凸显了HTLV-1治疗的潜力以及当前可用抗病毒药物库的有限性。即使成功，若无额外的抗病毒靶点，联合疗法的范围将受限，从而增加病毒逃逸的真实可能性。

近年来，对抗HIV感染的最新策略是“衣壳抑制”。对HIV衣壳的研究表明，衣壳并非惰性“外壳”，而是协调病毒感染的许多早期阶段。在病毒生命周期的进入后早期阶段，衣壳保护病毒遗传物质免受核酸酶（如TREX）和先天传感器（如cGAS）的侵害；它结合马达蛋白以在细胞质中导航；它作为半透性反应室促进逆转录过程；它介导核进入；并在核内分区进入膜性无区室，指导病毒DNA整合到常染色质的特定区域。值得注意的是，衣壳由单一蛋白质CA构成，组装成一个包含约250个CA六聚体和恰好12个CA五聚体的富勒烯锥体。组装衣壳的稳定性经过精细调节，因为它必须在核内适当的时间和地点“脱壳”以释放病毒DNA。衣壳的多功能性和亚稳定性意味着CA突变通常会给病毒带来显著的适应性代价。这种“遗传脆弱性”以及衣壳带有宿主结合口袋的事实，使得HIV衣壳在近年来成为一个有吸引力的药物靶点。

Lenacapavir是首个获批的同类抗衣壳药物，于2022年获得欧盟（EU）和美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于经治经验丰富、具有多重耐药性HIV感染的成人。由于其从注射部位释放缓慢和清除时间长，lenacapavir仅需每半年给药一次。因此，它正被考虑用于暴露前预防，并且是首个在3期HIV预防试验中显示零感染的抗病毒药物。Lenacapavir是基于HIV CA蛋白的X射线晶体结构设计的。它主要结合在HIV CA N端结构域（CA_NTD）表面由螺旋3、4和5之间形成的疏水口袋。与邻近CA单体C端结构域（CA_CTD）上的螺旋8和9的额外接触确保药物优先结合组装的衣壳晶格。HIV利用该位点与多种宿主蛋白结合，包括Sec24C、CPSF6和核孔复合物的苯丙氨酸-甘氨酸（FG）重复结构域。通过结合该位点，lenacapavir不仅抑制宿主辅助因子结合，还促进异常衣壳组装并破坏成熟衣壳完整性。这些多重作用机制解释了lenacapavir的高效力（EC₅₀= 23 pM），并凸显了靶向反转录病毒衣壳的治疗价值。

尽管HTLV-1衣壳在亚型间几乎相同，存在超过50,000年的分化，但其高度保守性表明HTLV-1衣壳可能同样具有遗传脆弱性，高度优化以适应人类宿主，也可能代表开发长效预防剂的可行靶点。作为一种无酶活性的结构蛋白，有必要了解HTLV-1 CA蛋白的结构、其晶格形成和相互作用，以加速该领域的药物开发。

本研究聚焦于解析成熟长度HTLV-1c CA蛋白的高分辨率晶体结构。研究人员克服了先前研究中报道的HTLV-1a CA蛋白表达和纯化困难，发现HTLV-1c CA及其组成结构域易于表达，是高度稳定的蛋白质，其晶体分辨率常规超过已得到更广泛研究的HIV CA。研究成功解析了HTLV-1c CA_NTD的原子分辨率结构，揭示了其与HIV-1 CA_NTD的结构差异，如缺乏螺旋6、更短的环区结构以及固定的N端β-发夹“开放”构象。

NTD 与 HIV-1 CA_NTD的结构比较。a HTLV-1 CA_NTD1-127的二级结构元素标记。b HTLV-1 CA_NTD与 HIV-1 CA_NTD（PDB 4XFX）叠加比较。'>

研究人员还获得了HTLV-1 CA_NTD的六方晶型，揭示了衣壳晶格堆积的特征，包括由六个K18残基在六聚体中心形成的带正电的“孔”。

NTD 六方晶格的特征及相互作用界面。a, b 六方晶型中HTLV-1 CA_NTD形成六聚体并扩展为六方晶格。e HTLV-1 CA_NTD六聚体中心由K18形成带正电的孔（直径20.2 ?）。'>

全长成熟HTLV-1 CA蛋白结晶为六方晶格。结构分析表明，其晶格堆积更接近于未成熟衣壳晶格，与α-和β-反转录病毒晶格相似，而与HIV（慢病毒）的成熟晶格不同。CTD形成不对称的同源二聚体，由螺旋9介导。

通过与其他反转录病毒（如RSV、MLV）的冷冻电子断层扫描子断层图平均结构比较，进一步确认了HTLV-1c CA晶体堆积与未成熟晶格的一致性。

在晶体筛选中，研究人员在HTLV-1 CA_NTD的正交晶型中发现了一个硫酸根（SO₄^2-）结合口袋。该口袋由螺旋3、4、5和7形成，由残基H71、H72、R98和W117协调。该位点在结构上等同于HIV-1 CA_NTD中结合宿主因子（如CPSF6、FG-nucleoporins）和药物lenacapavir的位点。

NTD正交晶型中发现的SO₄结合口袋。a-c 无配体（apo）和SO₄结合的CA_NTD结构叠加显示结合位点。d 该位点结构上等同于HIV-1 CA_NTD中的FG结合位点。e-g HIV-1 CA中该位点被lenacapavir、NUP153或CPSF6占据。'>

为验证该口袋的功能重要性，研究人员构建了21个HTLV-1c CA表面残基点突变体，并在复制依赖的感染系统中测试其感染性和病毒粒子产生。突变靶点包括六聚体内界面、NTD三聚体界面、CTD二聚体三聚体界面以及硫酸盐/磷酸盐结合口袋。结果显示，结合口袋关键残基（H71A, H72A, R98A, W117A）的突变完全废除了病毒感染性，并伴随病毒粒子产生的减少，表明该位点对衣壳功能至关重要。此外，还发现了一个能提高感染性的突变体H190A。

关键实验技术方法

本研究主要运用了分子克隆技术构建HTLV-1c CA及其结构域（全长、NTD、CTD）的重组表达载体；在大肠杆菌Rosetta 2(DE3) pLysS中过量表达重组蛋白；通过硫酸铵沉淀、离子交换色谱和尺寸排阻色谱纯化蛋白；采用坐滴法和悬滴法蒸汽扩散法进行蛋白质结晶筛选和优化；利用同步辐射X射线衍射（澳大利亚同步辐射中心MX2光束线）收集晶体衍射数据；使用分子置换法（以AlphaFold2预测模型或已解析结构作为搜索模型）解析晶体结构，并通过Phenix和Coot进行结构修正和优化；采用纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）分析蛋白热稳定性；利用基于荧光报告基因的复制依赖型HTLV-1细胞间感染系统（使用HEK-293T细胞）进行点突变体的感染性表型分析；通过流式细胞术检测GFP阳性细胞以评估感染性，并使用p19 ELISA检测病毒粒子产量。

研究结果

Atomic resolution of HTLV-1 CA_NTD

研究人员成功解析了HTLV-1c CA_NTD（残基P1-S127）的原子分辨率（0.87 ?）晶体结构。结构显示了一个N端β-发夹（残基1-13），随后是6个α-螺旋和一个位于螺旋4和5之间的附加3₁₀螺旋。与HIV-1 CA_NTD的结构比对揭示了三个主要差异：HTLV-1 CA缺乏HIV中的螺旋6；具有更短、更紧凑的4-5环（相当于HIV的亲环蛋白结合环），且不含构象动态的异构肽键；HTLV-1 CA的N端β-发夹固定于“开放”构象，不像HIV-1 M群病毒那样具有pH依赖性构象切换能力。

Hexagonal crystal form of HTLV-1 CA_NTDreveals capsid lattice packing

HTLV-1 CA_NTD的六方晶型（P622）显示了由晶体学对称性生成的六方“片层”结构，其特征类似于其他反转录病毒衣壳晶格堆积。六聚体中心由六个K18残基形成一个带正电的孔，其直径（20.2 ?）大于HIV-1中由R18形成的孔（16.2 ?）。

Full-length mature HTLV-1 CA crystallises as a hexagonal lattice

全长HTLV-1 CA（P1-L214）晶体结构解析至2.25 ?分辨率。尽管具有成熟的N端β-发夹和盐桥（P1-D54），但其晶格堆积（NTD和CTD处于不同平面，晶格间距较近，74.6 ?）与已知的未成熟衣壳晶格（如HTLV-1a、RSV、MLV）更为一致，而与HIV的成熟晶格（NTD和CTD处于同一平面，间距92.0 ?）不同。CA_CTD形成由螺旋9介导的不对称同源二聚体。比较分析强烈表明，该全长CA晶体结构代表了一种更接近于未成熟状态的晶格堆积，可能是一种成熟中间体。

Crystallant binding pocket may indicate a druggable site

在含有硫酸铵的结晶条件下，在HTLV-1 CA_NTD表面由螺旋3、4、5和7形成的电正性口袋中明确解析出一个硫酸根离子，该口袋由H71、H72、R98和W117协调。该位点在结构上等同于HIV-1 CA中结合宿主因子（Sec24C、CPSF6、FG-nucleoporins）和lenacapavir的疏水口袋。通过晶体浸泡实验证实，该口袋也能结合磷酸根离子。配体结合诱导了H72和R98等残基的构象变化。

Capsid surface residues mediate infectivity and/or particle production

点突变分析表明，位于六聚体内界面、NTD三聚体界面、硫酸盐/磷酸盐结合口袋和CTD二聚体界面的关键残基突变对病毒感染性和/或病毒粒子产生具有显著影响。特别是，硫酸盐/磷酸盐结合口袋的关键残基（H71A, H72A, R98A, W117A）突变完全废除了感染性并减少了病毒粒子产生，凸显了该位点的重要性。此外，发现了能提高感染性的突变体H190A。测试的所有突变残基在已知HTLV-1亚型间完全保守。

结论与讨论

本研究首次报道了HTLV-1c CA蛋白及其结构域的高分辨率晶体结构，分辨率超越了已得到广泛研究的HIV CA。结构揭示了HTLV-1 CA与HIV CA在关键表面特征上的显著差异，如固定的β-发夹、缺乏螺旋6和更紧凑的4-5环，表明其胞质面构象动态性远低于HIV。全长CA晶格堆积更接近于未成熟状态，类似于α-和β-反转录病毒，提示其可能代表一种成熟中间体。

最重要的发现之一是鉴定了一个在HTLV-1 CA_NTD上由螺旋3、4、5和7形成的电正性配体结合口袋，该口袋在结构上等同于HIV CA中关键的宿主因子结合和药物（lenacapavir）靶向位点。尽管HTLV-1对该药物不敏感，但该口袋能结合硫酸根/磷酸根离子，且其关键残基对病毒 infectivity 和粒子产生至关重要。这强烈提示该位点是HTLV-1衣壳功能的关键，并且由于其高保守性，是一个有前景的、可能对所有HTLV-1亚型有效的抗病毒药物开发靶点。

研究还发现了一些仅降低感染性而不影响粒子产生的表面突变体（如K18A），以及一个能增强感染性的罕见突变体（H190A），这些位点值得进一步研究以揭示衣壳功能的新方面。

总之，该研究为理解HTLV-1衣壳结构奠定了基础，并有力地支持了衣壳作为HTLV-1治疗和预防（尤其是开发长效暴露前预防剂）的一个脆弱且可行的药物靶点。重组CA蛋白的稳健性和易于获得高分辨率晶体结构的能力，为基于结构的药物设计和筛选平台的开发提供了可行性。对HTLV-1衣壳功能和相互作用的进一步理解，无疑将为如何最有效地干预HTLV-1传播提供重要见解。