Vap33-Eph-Vav信号轴通过精确调控Cdc42激活时序协调运动神经元树突发生

《Nature Communications》：The Vap33 signaling axis precisely coordinates the timing of motoneuron dendritogenesis in neural map development

本研究揭示了果蝇运动神经元树突发生过程中的关键时序调控机制。研究人员发现，内质网驻留蛋白Vap33在树突发生起始阶段被分泌至胞外，作为配体激活Eph受体酪氨酸激酶，进而招募鸟嘌呤核苷酸交换因子Vav至细胞膜并激活Cdc42 GTPase，最终驱动树突丝状伪足形成。该研究首次阐明了Vap33在神经环路构建中的非自主性调控功能，为理解人类VAPB相关肌萎缩侧索硬化症(ALS8)的发病机制提供了新视角。

　　

在大脑发育过程中，神经元通过精确的轴突和树突模式形成特定的神经连接图谱，这一过程的失调会导致神经系统功能异常。尽管人们对引导树突定向生长的分子机制已有较多认识，但调控树突发生起始时间的关键机制仍不清楚。果蝇运动神经元为研究这一过程提供了理想模型，其树突在胚胎发育过程中以高度同步的方式在特定时间点出现，暗示存在精确的时序调控机制。

此前研究发现，肌动蛋白调节因子Cdc42 GTPase在这一过程中发挥关键作用，但其上游激活机制尚未阐明。发表在《Nature Communications》的这项研究，通过系统的实验分析，揭示了一条由Vap33-Eph-Vav组成的信号轴，它通过精确控制Cdc42的激活时间，协调运动神经元树突发生的启动。

研究人员主要运用了单细胞遗传学分析、FRET-based活体成像技术、免疫共沉淀等生物化学方法、免疫组织化学染色、以及行为学分析等关键技术方法。其中，单细胞RNA测序数据来自NCBI GEO数据库（编号GSE202987），果蝇遗传操作使用了多种GAL4/UAS系统组合。

研究结果

The Rho Family GEF Vav Has a Cell-Autonomous Function in aCC Dendritogenesis

通过RNAi筛选18个Cdc42 GEFs，发现Vav对树突丝状伪足形成至关重要。Vav突变体中树突丝状伪足数量显著减少，且这一表型可通过在aCC运动神经元中特异性回补Vav得到挽救，表明Vav以细胞自主方式发挥作用。

Cdc42 GTPase is activated by Vav in the aCC Motoneuron

使用FRET-based的Cdc42活性探针（aProbe）发现，在野生型胚胎中，Cdc42在13:00 AEL（产卵后小时）在轴突近端被特异性激活，与树突丝状伪足出现时间一致。而在Vav突变体中，该区域的Cdc42激活显著降低，证明Vav是调控Cdc42激活的关键GEF。

The Eph receptor activates Cdc42 and plays a cell-autonomous role in Dendritogenesis

Eph受体酪氨酸激酶被鉴定为Vav的上游调控因子。Eph突变体不仅表现出与Vav突变体相似的树突缺失表型，其Cdc42激活也显著受损。遗传挽救实验证实Eph在aCC运动神经元中自主调控树突发生。

Vav SH2 domain and Eph tyrosine residues essential for dendritic outgrowth

生化实验证明Vav的SH2结构域与Eph受体近膜区的磷酸化酪氨酸残基直接相互作用。缺失Vav的SH2结构域或突变Eph的酪氨酸磷酸化位点均会破坏两者相互作用，且无法挽救各自的突变表型，表明磷酸化依赖的相互作用对信号通路功能至关重要。

Membrane localization of Vav is essential for dendritic filopodia outgrowth

构建膜锚定形式的Vav（myr-Vav^DH-PH）可在Eph突变体中挽救树突表型，而胞质定位的野生型Vav或无催化活性的膜锚定Vav（myr-Vav^DH[AA]-PH）则无此功能，证明Vav的膜定位及其GEF活性对其功能不可或缺。

Vap33 cooperates with Eph to activate Cdc42 during aCC Dendritogenesis

Vap33被鉴定为Eph的潜在配体。Vap33突变体表现出树突丝状伪足减少和Cdc42激活受损，而Ephrin突变体无此表型。免疫共沉淀证实Vap33与Eph的配体结合域直接相互作用，遗传互作实验显示Vap33和Eph在树突发生中协同作用。

aCC dendritic Filopodia outgrowth requires the non-cell-autonomous role of Vap33

单细胞RNA测序和免疫染色显示Vap33在多种神经元中表达。关键的是，在aCC以外的神经元中表达Vap33可挽救Vap33突变体的表型，而在aCC自身中表达则不能，证明Vap33以非细胞自主方式发挥作用。

Vap33 is a temporal regulator for dendritic filopodia formation in motoneurons

在树突发生起始时间（13:00 AEL）之前，细胞外Vap33水平极低，之后显著升高。分泌缺陷型突变体Vap33^P58S（对应人类ALS8相关突变VAPB^P56S）无法挽救突变表型。此外，Vap33突变影响多种运动神经元的树突发生，表明其调控具有普遍性。

研究结论与意义

该研究揭示了一条新颖的Vap33-Eph-Vav-Cdc42信号轴，它通过精确控制Cdc42的激活时间，协调运动神经元树突发生的启动。在发育时间点上，Vap33从周围神经元分泌至细胞外空间，可能作为配体激活aCC运动神经元上的Eph受体。Eph自磷酸化后，为Vav的SH2结构域提供膜锚定位点，促使Vav激活Cdc42，进而驱动肌动蛋白聚合和树突丝状伪足形成。

该研究的创新性在于发现了Vap33作为时序调控分子的新功能，以及Eph-Vav在果蝇中特异性调控Cdc42（而非Rac1）的机制。更重要的是，Vap33的人类同源蛋白VAPB与肌萎缩侧索硬化症8型（ALS8）密切相关，其突变体VAPB^P56S不仅形成蛋白聚集体，还影响其正常分泌和功能。本研究提示VAPB信号可能在运动环路形成中发挥重要作用，其失调可能通过影响发育时期的树突模式建立，为ALS的发病机制提供了新的发育视角。此外，Cdc42激活的空间特异性可能由Eph受体在轴突近端的局部富集所决定，这为理解神经元极性提供了新线索。