细胞色素c氧化酶依赖性呼吸作用在T细胞活化、增殖及记忆形成中的核心机制研究

《Nature Communications》：Cytochrome c oxidase dependent respiration is essential for T cell activation, proliferation and memory formation

本研究针对T细胞代谢重编程中线粒体呼吸作用的具体功能尚不明确的问题，通过表达非质子泵送的替代氧化酶AOX，在细胞色素c氧化酶缺陷的T细胞中特异性恢复了线粒体呼吸。结果表明，AOX介导的电子传递可重建膜电位与ATP合成，挽救T细胞增殖、效应/记忆分化及抗病毒免疫，且该过程依赖复合物I的电子输入。这一发现揭示了线粒体呼吸独立于质子泵送功能对T细胞命运决定的关键作用，为免疫代谢研究提供了新视角。

　　

当T细胞遇到抗原时，它们会启动一场深刻的代谢革命，从静息状态迅速转变为高度活跃的增殖状态，以执行免疫防御任务。长期以来，科学界将目光聚焦于糖酵解的爆发式增强，认为这是驱动T细胞克隆扩张的主要动力。然而，作为细胞能量工厂的线粒体，其呼吸作用在这一关键过程中的具体角色却笼罩在迷雾之中。线粒体氧化磷酸化不仅产生ATP，还涉及活性氧生成、凋亡调控等复杂信号传导，但呼吸功能与质子泵送功能的贡献究竟孰轻孰重，始终是未解之谜。

来自美国国立卫生研究院国家人类基因组研究所的Tatiana N. Tarasenko、Emily Warren等研究人员在《Nature Communications》上发表的最新研究，通过巧妙的遗传学操作，成功将呼吸功能与质子泵送功能解耦，揭示了细胞色素c氧化酶依赖性呼吸对T细胞活化、增殖和记忆形成不可或缺的作用。

研究人员首先构建了T细胞特异性缺失COX10基因的小鼠模型（TCox10^-/-），该基因编码的酶是细胞色素c氧化酶关键辅基血红素a合成所必需的。这些T细胞因此缺乏完整的复合物IV功能，线粒体呼吸严重受损。为了特异性恢复呼吸而不伴随质子泵送，研究团队引入了一种来自玻璃海鞘的替代氧化酶AOX。AOX能够直接将电子从泛醌传递给氧气生成水，绕过复合物III和IV，且不泵送质子。通过杂交育种，他们获得了T细胞同时缺失Cox10但表达AOX的小鼠模型（TCox10^-/-/Aox）。

研究发现，AOX的表达能够有效恢复COX缺陷T细胞的氧消耗速率，尽管细胞色素c氧化酶本身的活性依然缺失。转录组分析显示，AOX重塑了基因表达谱，纠正了与细胞周期、凋亡信号以及T细胞增殖分化相关的通路异常。在超微结构水平，COX缺陷导致的线粒体形态异常（如长度增加、数量减少）在AOX表达后得以逆转，恢复至类似野生型的结构。线粒体膜电位（ΔΨm）的失衡和活性氧的升高也被AOX显著改善，NAD⁺/NADH比率恢复正常，表明氧化还原稳态得到恢复。

尤为重要的是，研究揭示了维持AOX介导的呼吸所必需的电子输入来源。通过使用特异性抑制剂，他们发现复合物I的活性对于维持AOX表达细胞的膜电位和ATP合成至关重要。抑制复合物I会导致膜电位急剧下降和ATP合成显著减少。复合物II和二氢乳清酸脱氢酶的抑制也有影响，但程度较轻，表明它们主要通过维持泛醌库的还原状态来支持电子流。稳定同位素示踪实验进一步显示，AOX表达恢复了TCA循环的动态，使COX缺陷细胞中异常的谷氨酰胺代谢向野生型水平正常化。

一个出乎意料的发现是，尽管AOX恢复了线粒体呼吸和氧化还原平衡，糖酵解活性在TCox10^-/-/Aox细胞中依然维持在较高水平。细胞外酸化率和乳酸产量与未 rescued 的COX缺陷细胞相当。然而，糖酵解的上调并非由低氧诱导因子1α驱动，因为其蛋白水平在AOX表达后已恢复正常。这提示存在一种不依赖于HIF1α的、可能与改变了的氧化还原信号相关的机制，持续促进了糖酵解通量。

在功能层面，AOX介导的呼吸显著挽救了COX缺陷T细胞的存活。激活后72小时，TCox10^-/-/Aox T细胞的凋亡率显著降低，Caspase 3、8、9的活化水平下降。RNAseq数据映射到KEGG凋亡通路显示，AOX逆转了COX缺陷细胞中Fas、FasL等外源性凋亡通路关键分子的上调。体外功能实验证实，AOX表达使T细胞增殖能力恢复至野生型水平，甚至在叠氮化钠抑制内源性COX后仍能持续增殖。这种增殖依赖于复合物I、II和DHODH的电子输入。CD4⁺T细胞能够有效地分化为Th1和Th17效应亚群，细胞毒性CD8⁺T细胞也恢复了颗粒酶表达和靶细胞杀伤能力。

体内实验进一步验证了AOX的功能拯救作用。在适应性转移模型中，TCox10^-/-/Aox T细胞在抗原刺激后表现出比COX缺陷细胞显著改善的增殖能力。在流感病毒感染模型中，预先免疫X-31流感病毒后再用PR8病毒攻击，TCox10^-/-/Aox小鼠能够产生与野生型相当水平的病毒特异性记忆CD8⁺T细胞（针对NP_366-374和PA_224-233表位），并且肺部的病毒载量显著低于COX缺陷小鼠，表明其抗病毒免疫功能得到实质性恢复。

本研究的关键技术方法包括：利用条件性基因敲除和转基因小鼠模型构建T细胞特异性COX10缺失且表达AOX的基因工程鼠；通过细胞培养和激活实验模拟T细胞免疫应答；应用海马能量代谢分析系统测量氧消耗速率和细胞外酸化率；采用流式细胞术进行细胞表型、活性、凋亡、线粒体功能（膜电位、活性氧、ATP）等多参数检测；运用透射电子显微镜观察线粒体超微结构；通过RNA测序进行转录组学和加权基因共表达网络分析；利用气相色谱-质谱联用进行¹³C标记的葡萄糖和谷氨酰胺代谢流分析；以及建立体内流感病毒感染模型和适应性T细胞转移模型评估免疫应答。

研究结果部分通过系列实验证实：AOX表达可逆转COX缺陷导致的转录组异常，恢复细胞周期、凋亡和分化相关通路；AOX改善线粒体结构和氧化还原稳态，纠正膜电位和活性氧失衡；AOX-MR揭示复合物I是维持膜电位和ATP合成的关键电子输入源；尽管呼吸恢复，糖酵解在AOX拯救的细胞中仍持续活跃，提示存在不依赖于HIF1α的调控机制；AOX-MR通过抑制内外源性凋亡通路显著改善T细胞存活；AOX-MR支持T细胞体外增殖、效应/记忆分化和细胞毒性功能；体内实验证明AOX-MR可部分恢复T细胞增殖能力，并完全恢复抗病毒免疫记忆和病毒清除能力。

综上所述，这项研究确立了线粒体呼吸作用本身，而非其偶联的质子泵送功能，是T细胞成功活化和功能执行的必要条件。通过AOX这一分子工具，研究成功解析了呼吸作用在T细胞代谢重编程中的独立贡献，揭示了上游电子输入（尤其是复合物I）对维持呼吸功能的关键性。这不仅深化了对T细胞免疫代谢的理解，也为探索线粒体功能障碍相关免疫疾病的治疗策略提供了新的思路和靶点。研究表明，线粒体呼吸是协调T细胞命运决定的核心枢纽，其作用远超出简单的能量供应，涉及复杂的信号网络整合。