新型小分子TLR3激动剂佐剂PVP-057的发现及其在疫苗免疫中的广泛应用

《Nature Communications》：Discovery of a small molecule TLR3 agonist adjuvant

本研究针对现有TLR3激动剂多为大分子核苷酸类似物、存在合成困难及毒性较大等问题，通过高通量筛选发现了一种新型小分子TLR3激动剂PVP-057。研究证实PVP-057可通过TLR3-TRIF-TBK1-IRF3信号通路特异性激活天然免疫，在小鼠模型中单组分即可有效增强VZV gE、SARS-CoV-2 Spike蛋白等多种抗原的体液免疫和细胞免疫应答，其效果与临床标准佐剂AS01B相当。该化合物采用绿色化学方法实现了三步高效合成，为TLR3靶向治疗和疫苗研发提供了新的工具和策略。

　　

在疫苗研发领域，佐剂的作用不可或缺，它们能够增强抗原特异性免疫反应，提高疫苗的保护效果。然而，现有的佐剂选择有限，特别是针对特定模式识别受体（PRR）的佐剂更是少之又少。Toll样受体3（TLR3）作为识别双链RNA（dsRNA）的关键受体，在抗病毒免疫中扮演重要角色，但其激动剂主要是大分子核苷酸类似物，如poly(I:C)等，这些分子存在合成复杂、分子量大、毒性较强等问题，限制了其在临床中的应用。

目前TLR3激动剂的发展面临多重挑战。首先，核苷酸类激动剂分子量通常超过10 kDa，合成过程复杂，难以实现大规模生产。其次，这类分子往往激活多种信号通路，如poly(I:C)不仅激活TLR3，还能通过MDA5/RIG-I途径激活MAVS信号，导致潜在的脱靶效应和毒性反应。此外，现有TLR3激动剂的水溶性和稳定性较差，制剂困难，进一步限制了其临床应用。因此，研发一种小分子、特异性强、毒性低的TLR3激动剂佐剂成为该领域的迫切需求。

为了解决这一难题，波士顿儿童医院精准疫苗计划的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。研究人员通过高通量筛选技术，从20万个小分子化合物库中发现了一种噻唑苯甲酰胺衍生物PVP-057，该化合物能够特异性激活TLR3信号通路，并表现出优异的佐剂活性。

在研究过程中，团队采用了多种关键技术方法。他们利用THP-1单核细胞系进行高通量筛选，通过NF-κB活化和细胞粘附双指标筛选潜在活性化合物。采用基因敲除细胞系（包括MyD88、TBK1、IRF3、TRIF敲除）和受体过表达细胞系（HEK-hTLR3、HEK-hTLR4）进行机制验证。通过体外抑制实验使用TLR3特异性抑制剂CU-CPT4a确认作用靶点。在小鼠模型中评估了PVP-057经肌肉注射和皮内注射两种给药途径的佐剂效果，并与临床标准佐剂AS01B进行对比。此外，团队还开发了三步绿色合成路线，实现了PVP-057的高效、可放大合成。

PVP-057诱导THP-1细胞免疫调节且细胞毒性低

研究人员通过高通量筛选发现PVP-057能够显著诱导THP-1细胞的NF-κB和IRF信号通路活化，促进细胞表面共刺激分子CD80和CD86的表达，且不引起明显的细胞凋亡。浓度依赖性实验显示，在25μM浓度下，PVP-057诱导的IRF活性比DMSO对照组高约33倍，NF-κB活性高约6.5倍，表明其具有强烈的干扰素偏向性激活特性。

PVP-057介导的IRF和NF-κB信号激活依赖于TLR3

通过基因敲除细胞实验，研究人员发现PVP-057的活性不依赖于MyD88，但需要TBK1和IRF3的参与。更重要的是，TRIF敲除完全消除了PVP-057的活性，而TLR3过表达细胞实验证实PVP-057能够特异性激活TLR3信号通路，且这一活性可被TLR3特异性抑制剂CU-CPT4a所抑制。

PVP-057的高纯度合成具有可扩展性和时间效率

研究团队开发了一种三步合成路线，可在24小时内以约56%的收率获得纯度约98%的PVP-057。该合成方法具有良好的可扩展性，从初始的5毫克放大到1克规模，仍能保持一致的纯度和活性。不同批次合成的化合物在体外活性实验中表现出一致的效果。

PVP-057表现出强大的体内佐剂活性

小鼠实验表明，PVP-057通过肌肉注射和皮内注射均能显著增强水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E（VZV gE）的体液免疫反应，诱导产生的抗体滴度在184天内维持较高水平。特别值得注意的是，皮内注射PVP-057佐剂的免疫效果优于肌肉注射，且与临床标准佐剂AS01B相比，在诱导IgG和IgG1抗体方面表现出非劣效性。

PVP-057增强细胞免疫

除了体液免疫，PVP-057还能促进抗原特异性T细胞应答。皮内免疫后，PVP-057佐剂组小鼠脾脏CD4⁺T细胞中TNF和IL-2的表达显著增加，表明其能够诱导强大的细胞免疫反应。

PVP-057是TLR3依赖性佐剂

通过TLR3基因敲除小鼠实验，研究人员证实PVP-057的佐剂活性完全依赖于TLR3信号通路。与野生型小鼠相比，TLR3敲除小鼠中PVP-057佐剂的免疫增强效果显著降低，特别是Th1型免疫标志IgG2c抗体滴度下降了约13.86倍。

PVP-057可佐剂三价人类疱疹病毒疫苗

在多价疫苗应用中，PVP-057同样表现出色。当与VZV gE、HSV gD2和CMV gB三种疱疹病毒抗原共同使用时，PVP-057能显著增强针对所有三种抗原的抗体反应，展示了其作为多价疫苗佐剂的潜力。

本研究发现的PVP-057是首个被证实的小分子TLR3激动剂，具有分子量小（约574 g/mol）、合成简便、特异性强、毒性低等优点。与现有核苷酸类TLR3激动剂相比，PVP-057的分子量仅为RGC100的约1/130，且合成过程更加绿色环保。

该研究的创新性在于首次报道了小分子化合物能够特异性激活TLR3信号通路，为TLR3靶向治疗提供了新的工具分子。PVP-057不仅可作为疫苗佐剂应用于传染性疾病防治，还有潜力用于肿瘤免疫治疗、自身免疫性疾病治疗等领域。

更重要的是，PVP-057的成功发现为克服现有TLR3激动剂的局限性提供了新的解决方案。其简单的化学结构、可放大的合成工艺以及良好的安全性特征，使其具有广阔的临床应用前景。特别是在精准疫苗学领域，PVP-057有望为不同人群（如老年人和婴幼儿）定制个性化疫苗策略提供新的选择。

总的来说，PVP-057的发现不仅丰富了TLR3信号调控的分子工具库，也为疫苗佐剂研发开辟了新的方向。随着后续研究的深入，这种小分子TLR3激动剂有望在感染性疾病预防、肿瘤免疫治疗等多个领域发挥重要作用，为人类健康保驾护航。