基于翻译后修饰的分泌蛋白质组时空图谱揭示衣康酸修饰激活的酪氨酸激酶FYN

《Nature Communications》：Spatiotemporal profiling of modification-specific proteome secretion uncovers an itaconation-activated tyrosine kinase

本研究针对巨噬细胞分泌蛋白质组的翻译后修饰(PTM)调控机制这一前沿问题，开发了PTM-based secretome profiling(PBSP)新技术。研究人员通过生物正交探针标记、FISAP富集和DIA质谱分析，首次绘制了衣康酸修饰(itaconation)分泌蛋白的时空动态图谱，发现818个itaconated分泌蛋白，并证实酪氨酸激酶FYN的Cys239位点衣康酸修饰可增强其激酶活性。该研究为理解PTM在细胞间通讯中的调控功能提供了全新视角，发表于Nature Communications。

　　

在免疫学研究领域，巨噬细胞作为重要的免疫哨兵，通过分泌大量信号蛋白来协调复杂的免疫应答过程。这些分泌蛋白中近半数缺乏信号肽，需要通过外泌体等非常规途径分泌到细胞外空间。然而，目前对调控这些蛋白分泌的分子机制，特别是翻译后修饰(PTM)在其中发挥的作用，了解甚少。

与此同时，巨噬细胞在病原体感染或肿瘤微环境中会产生大量衣康酸(itaconate)，这种免疫调节代谢物能够通过其α,β-不饱和羧酸结构共价修饰蛋白质半胱氨酸残基，这一过程被称为衣康酸修饰(itaconation)。已知的衣康酸修饰靶点包括KEAP1、ALDOA、JAK1等重要免疫调节因子，它们参与调控NRF2抗氧化通路、糖酵解和细胞焦亡等关键过程。然而，现有研究主要聚焦于细胞内蛋白质的衣康酸修饰，对于分泌蛋白的衣康酸修饰及其在细胞间通讯中的作用仍知之甚少。

更令人遗憾的是，尽管近年来发展了TransitID等时空分辨蛋白质组技术，能够无偏倚地绘制蛋白质运输和分泌图谱，但这些方法缺乏足够的分辨率来研究特定修饰形式的蛋白质分泌。PTM如磷酸化、糖基化和酰化已知能够调控蛋白质运输和分泌，但现有研究多集中于单个蛋白或通路，迫切需要能够大规模、无偏倚分析PTM调控蛋白质分泌的方法。

针对这一技术瓶颈，清华大学秦炜团队与中国药科大学庄慎天团队合作，在Nature Communications上发表了题为"Spatiotemporal profiling of modification-specific proteome secretion uncovers an itaconation-activated tyrosine kinase"的研究论文。该研究开发了一种名为PTM-based secretome profiling(PBSP)的新方法，能够精确追踪携带特定PTM的蛋白质分泌过程。

研究人员采用的技术方法主要包括：利用生物正交探针(如ITalk)在活细胞中进行脉冲标记；通过离心柱亲和纯化(FISAP)平台进行低样本量下的高效富集；结合数据非依赖采集(DIA)质谱技术提高检测灵敏度和重现性；使用外泌体抑制剂GW4869区分不同分泌途径；通过点突变和体外修饰实验验证特异性修饰位点；利用LPS刺激和IRG1基因敲除细胞模型验证内源性调控机制。

Establishment of PBSP

研究团队首先以衣康酸修饰为概念验证体系，利用衣康酸-炔烃(ITalk)探针在活体巨噬细胞中标记衣康酸修饰蛋白。通过脉冲标记2小时后洗脱探针，再在无血清培养基中追踪12小时，成功实现了分泌蛋白中衣康酸修饰的时空动态分析。实验证实，ITalk标记过程不影响衣康酸代谢，且能够在分泌组中检测到与细胞内明显不同的标记模式。

Development of a streamlined proteomic workflow for PBSP

为解决传统数据依赖采集(DDA)质谱方法的随机数据丢失问题，研究团队建立了FISAP与DIA质谱联用的工作流程。这一优化方案显著提高了检测灵敏度和重现性，在三个生物学重复中显示出高度相关的富集比率。最终从巨噬细胞分泌组中鉴定出818个ITalk标记的衣康酸修饰分泌蛋白。

Analysis of ITalk-labeled secreted proteins

数据分析显示，鉴定到的衣康酸修饰分泌蛋白中70%为已知分泌蛋白，且与既往细胞内衣康酸修饰图谱高度重叠。KEGG通路分析表明这些蛋白富集于蛋白酶体、碳代谢和氨基酸生物合成等通路，而新发现的衣康酸修饰蛋白则主要与溶酶体、核糖体、糖降解和COVID-19相关。值得注意的是，研究鉴定到多个关键免疫相关蛋白，如RIG-I、MAPK1和MAPK3，均为首次被发现同时经历衣康酸修饰和分泌。

Identification of exosome-dependent ITalk-labeled secreted proteins

通过使用外泌体抑制剂GW4869，研究团队进一步鉴定了447个外泌体依赖的衣康酸修饰分泌蛋白。这些蛋白中包括已知的功能性衣康酸修饰底物GSDMD，其通过外泌体途径分泌，提示衣康酸修饰可能进一步影响其在受体细胞中的功能活性。基因本体(GO)分析显示这些蛋白富集于蛋白质运输、折叠和稳定等生物过程。

Itaconation of FYN at Cys239 promotes FYN kinase activity

在新型衣康酸修饰蛋白中，研究团队重点关注了酪氨酸激酶FYN。生化验证证实FYN确实发生衣康酸修饰，质谱分析鉴定出六个潜在修饰半胱氨酸位点。通过点突变实验，最终确定SH2结构域中的Cys239是FYN的主要衣康酸修饰位点。值得注意的是，这一修饰显著抑制了FYN Tyr531的磷酸化，而Tyr531是FYN的抑制性磷酸化位点，表明衣康酸修饰增强了FYN激酶活性。在LPS刺激的巨噬细胞中，内源性衣康酸的积累同样导致FYN Tyr531磷酸化水平下降，且这一效应在IRG1敲除细胞中消失，证实了衣康酸在此过程中的必要性。

Identification of succinated secreted proteins via PBSP

为展示PBSP平台的普适性，研究团队还将该方法应用于琥珀酸修饰(succination)的分泌蛋白分析。使用富马酸-炔烃探针，鉴定到与衣康酸修饰几乎不重叠的琥珀酸修饰分泌蛋白，这些蛋白主要富集于补体和凝血级联、谷胱甘肽代谢和蛋白酶体功能等通路，表明不同PTM对底物分泌存在特异性调控机制。

该研究的创新性在于首次开发了能够精确追踪PTM特异性蛋白质分泌的技术平台，揭示了衣康酸修饰在调控蛋白质分泌和细胞间通讯中的全新功能。特别是发现FYN激酶的衣康酸修饰增强其活性，并通过外泌体途径分泌，为理解肿瘤微环境等病理条件下免疫细胞与靶细胞间的通讯机制提供了新视角。

研究也存在一定局限性，如化学探针与天然PTM在结构上存在差异，可能影响其功能性和分泌过程；当前技术尚无法解析细胞内PTM介导的运输过程。未来开发细胞器特异性标记策略将有助于在更高分辨率下揭示PTM调控的细胞内蛋白质动态。

总之，这项研究不仅提供了强大的技术平台PBSP，还创建了宝贵的衣康酸修饰和琥珀酸修饰分泌蛋白资源，为深入探索PTM在细胞间通讯中的功能奠定了基础。这些发现对于理解免疫代谢调控、肿瘤微环境交流等生物学过程具有重要意义，也为相关疾病治疗策略的开发提供了新思路。