FLICK-PE系统：双链切口策略大幅提升双子叶植物引导编辑效率并创制草甘膦抗性大豆

《Nature Communications》：A flanking-nicks prime editor (FLICK-PE) system to boost prime editing in dicots

本研究针对引导编辑（Prime Editing, PE）在双子叶植物中效率低下的难题，开发了侧翼双切口引导编辑系统（FLICK-PE）。该系统通过在同一条非编辑链上引入两个侧翼切口，定向调控DNA错配修复（MMR）路径，使大豆和烟草的精准编辑效率较PE2提升15.7倍，较PE3提升2.2倍。研究成功在大豆EPSPS1a基因引入TAP-IVS三重氨基酸突变，获得可稳定遗传的草甘膦抗性种质，为双子叶作物精准育种提供了高效工具。

　　

在精准育种技术飞速发展的今天，引导编辑（Prime Editing, PE）作为一种能够实现精准碱基替换、插入和删除的基因编辑工具，为作物改良带来了革命性潜力。然而，这一技术在单子叶作物（如水稻）中已取得显著进展，却在双子叶植物（如大豆、烟草）中面临效率低下的瓶颈。尽管研究者通过优化编辑器表达、增强转录效率等策略不断尝试，可遗传的PE编辑在双子叶植物中仍难以实现。这一困境严重制约了PE技术在重要经济作物中的应用。

为突破这一限制，广州大学关岳锋团队联合国内多家科研单位，在《Nature Communications》发表了题为“A flanking-nicks prime editor (FLICK-PE) system to boost prime editing in dicots”的研究。团队通过系统性优化PE组件并创新性引入侧翼双切口策略，成功将大豆的PE效率提升至可稳定遗传的水平，并创制出草甘膦抗性新种质。

研究主要采用以下方法：首先通过农杆菌介导的大豆发根转化系统快速筛选高效PE工具；利用Hi-TOM高通量测序技术精准量化编辑效率；通过稳定转化大豆品种“华春6号”和烟草验证FLICK-PE的遗传性；针对EPSPS1a等靶点设计pegRNA和切口sgRNA，并评估脱靶效应。

常规PE优化策略在大豆中效率低下

研究团队首先测试了5种不同组合的PE工具（SoyPE-V1至V5），包括优化启动子（如proM4、proUBQ3）、使用增强型nCas9-MMLV PEmax编辑器等策略。然而，在7个靶点的大豆发根实验中，最高编辑效率仅达19.52%，且稳定转化后无法获得可遗传编辑事件。即使联合表达人源RNA去甲基化酶hFTO（SoyPE-V6），编辑效率仍低于20%，表明常规优化策略不足以解决双子叶植物PE效率瓶颈。

切口sgRNA显著提升大豆PE效率

团队提出假设：大豆PE效率低下可能与DNA修复机制更倾向于保留非编辑链有关。通过引入PE3策略（在非编辑链添加切口sgRNA），发现在40–70 bp下游设计切口时，编辑效率较PE2提升4.7–11.8倍，最高效率达79%。而编辑链切口（PE-ES^nick）策略效果有限，证实非编辑链的调控是关键。

FLICK-PE通过双切口策略实现高效编辑

基于PE3的成功，团队进一步设计FLICK-PE系统，在非编辑链靶点两侧各引入一个切口sgRNA。与PE3相比，FLICK-PE在大豆发根中的平均编辑效率提升2.2倍（最高35.8倍），有效编辑效率（编辑占比>20%）达21%。此外，抑制MMR通路基因GmMLH1可提升PE2/PE3效率，但对FLICK-PE无显著增益，表明双切口已最大程度克服MMR抑制作用。

FLICK-PE在大豆稳定转化中验证有效性

在稳定转化实验中，FLICK-PE在3个靶点（EPSPS1a等）的有效编辑效率为11.1%–21.1%，显著高于PE3（3.1%–8.7%）。通过引入EPSPS1a基因的TAP-IVS突变，成功获得可遗传的草甘膦抗性大豆株系，田间试验显示其在高浓度草甘膦处理下仍保持正常育性。

FLICK-PE在烟草中展现普适性

烟草瞬时转化和稳定转化实验进一步验证了FLICK-PE的广适性。在4个靶点中，FLICK-PE较PE2和PE3分别平均提升8.15倍和1.49倍编辑效率，其中ALS1基因的W504L突变效率达19.4%，证实该系统在双子叶植物中具有广泛适用性。

结论与展望

本研究开发的FLICK-PE系统通过侧翼双切口策略定向调控MMR通路，突破了双子叶植物PE效率瓶颈。该技术不仅为大豆、烟草等作物的精准育种提供了高效工具，也为理解植物DNA修复机制提供了新视角。未来，FLICK-PE可与双pegRNA策略、病毒载体递送等技术结合，进一步拓展其在作物改良中的应用潜力。