光生物调节通过TRPV1-Ca2+-ROS信号通路促进半月板源干细胞线粒体功能与增殖的机制研究

《Scientific Reports》：Photobiomodulation stimulates mitochondrial function and cell proliferation in meniscus-derived stem cells (MeSCs) via activation of TRPV1 channel

本研究针对半月板自我修复能力差、干细胞治疗中细胞扩增困难的临床难题，系统探讨了不同波长（400-405nm、500-505nm、700-710nm、1064nm）和能量密度（3/15/30/60 J/cm2）的光生物调节（PBM）对半月板源干细胞（MeSCs）的作用机制。研究发现700-710nm和1064nm波长在15J/cm2时通过激活TRPV1通道上调Ca2+和ROS，显著促进细胞增殖并延缓衰老，为优化干细胞治疗提供了新策略。

　　

在运动损伤和退行性病变中，半月板损伤如同膝关节的"隐形杀手"，不仅导致关节疼痛和不稳，更是引发骨关节炎的重要诱因。虽然干细胞疗法为半月板修复带来了希望，但实践中却面临着一个棘手难题：从患者有限的半月板组织中获取的干细胞数量稀少，且在病理环境下活力受损，难以满足治疗所需的大规模扩增要求。

面对这一挑战，研究人员将目光投向了光生物调节（PBM）技术——一种利用低强度光照射调节细胞功能的非侵入性方法。尽管前期研究表明PBM能促进多种干细胞增殖，但其对半月板源干细胞（MeSCs）的作用机制却鲜为人知。更关键的是，科学界对PBM的作用机制存在三大假说争议：细胞色素C氧化酶（CCO）活化、一氧化氮（NO）释放和钙离子（Ca²⁺）信号通路，究竟哪种机制主导MeSCs的响应，仍是一个未解之谜。

发表在《Scientific Reports》的这项研究开创性地系统探讨了PBM对MeSCs的作用机制。研究团队采用LED光源，设置了四个波长（400-405nm、500-505nm、700-710nm、1064nm）和四个能量密度（3/15/30/60 J/cm²）的照射参数，通过功率计精确控制照射条件。

关键技术方法包括：从接受全膝关节置换术的男性捐赠者（66-75岁）获取半月板组织分离MeSCs；使用钙离子检测试剂盒测定细胞内Ca²⁺浓度；通过线粒体分离和CCO活性检测试剂盒评估酶活性；采用改进的Griess法测量NO水平；ELISA法检测ROS含量；MTT法分析细胞活力；JC-10荧光法测定线粒体膜电位（△Ψm）；细胞计数法评估增殖能力；ELISA检测细胞周期、凋亡和衰老相关蛋白表达；使用TRPV1抑制剂（CPZ）进行机制验证。

PBM上调MeSCs中的Ca²⁺水平

研究发现，所有波长和能量密度的LED照射均显著提高了细胞内Ca²⁺浓度，且呈现明显的剂量依赖性。在固定波长下，Ca²⁺水平随能量密度增加而逐步上升；在固定能量密度下，400-405nm和500-505nm波长的Ca²⁺增加幅度大于700-710nm和1064nm波长。

PBM不影响MeSCs中的CCO活性

研究通过比色法评估了PBM对MeSC线粒体中CCO活性的影响，发现所有波长和能量密度下的CCO活性均无显著变化，表明CCO可能不是PBM作用的主要介质。

PBM不影响MeSCs中的NO浓度

通过硝酸盐还原为亚硝酸盐的改进Griess法测定NO产生，结果显示各实验组的NO水平与对照组相比均无显著差异，排除了NO信号通路的主导作用。

PBM增加MeSCs中的ROS水平

ELISA检测显示，ROS水平的变化模式与Ca²⁺高度一致，在固定波长下随能量密度增加而上升，且400-405nm和500-505nm波长的增加幅度更大。

细胞活力与线粒体膜电位的变化

MTT实验显示，700-710nm和1064nm波长在3/15/30 J/cm²能量密度下促进细胞活力，而400-405nm和500-505nm波长在所有能量密度下均抑制活力。线粒体膜电位检测结果与此一致，700-710nm和1064nm波长在适当能量下增强△Ψm，而高能量（60 J/cm²）则产生抑制作用。

细胞增殖与衰老评估

细胞增殖实验表明，700-710nm和1064nm波长在3/15/30 J/cm²时显著提高细胞倍增数（NCPD）并缩短倍增时间（CPDT），其中15 J/cm²效果最优。衰老标志物β-半乳糖苷酶（β-GAL）检测证实，这些参数能有效延缓细胞衰老。

蛋白表达调控机制

ELISA分析发现，700-710nm和1064nm波长上调Bcl-2、Cyclin D1、CXCR-4等促增殖蛋白，下调Bax、Caspase-3、Caspase-9、p21、p53、p16等凋亡和衰老相关蛋白，而其他波长组呈现相反趋势。

TRPV1通道的关键作用

使用TRPV1抑制剂CPZ后，PBM诱导的Ca²⁺和ROS上升被显著抑制，同时细胞活力、△Ψm、增殖能力及相关蛋白表达变化均被逆转，证实TRPV1-Ca²⁺-ROS信号轴的核心地位。

本研究首次系统阐明了PBM通过TRPV1-Ca²⁺-ROS信号通路调控MeSCs功能的分子机制，揭示了典型的"双相剂量效应"：适当参数（700-710nm/1064nm，15 J/cm²）通过适度上调Ca²⁺（5.4-19.0%）和ROS（3.2-15.7%）促进细胞功能，而过度刺激则产生抑制作用。这一发现不仅解决了PBM作用机制的长期争议，排除了CCO和NO通路的主导作用，更为优化半月板干细胞治疗提供了精确的参数指导。研究建立的TRPV1调控机制为开发新型光调控干细胞疗法奠定了理论基础，具有重要的临床转化价值。