胆汁代谢物棕榈酸通过ROS/NF-κB信号通路增强胆囊癌细胞迁移机制研究

《Scientific Reports》：Bile metabolite palmitic acid augments the migration of gallbladder cancer cells through the ROS/NF-кB signaling pathway

本研究聚焦胰腺胆道反流（PBR）患者胆汁中显著升高的棕榈酸（PA），探讨其如何通过诱导活性氧（ROS）过度产生，激活NF-κB和NRF2/ARE信号通路，进而促进胆囊癌细胞上皮-间质转化（EMT）和迁移。研究揭示了PA在胆囊癌进展中的新机制，为靶向干预提供了理论依据。

　　

胆囊癌作为胆道系统最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展与多种风险因素密切相关，其中胰腺胆道反流（Pancreaticobiliary Reflux, PBR）被认为是一个重要的致病因素。PBR会导致胆汁成分改变，产生包括激活的胰酶和次级胆汁酸在内的致癌物质，直接或间接损伤胆囊黏膜，诱发反复的损伤-修复循环，最终可能导致癌变。然而，PBR导致胆囊癌的具体分子机制尚未完全阐明。以往研究发现，PBR患者胆汁中的游离脂肪酸（Free Fatty Acids, FFAs）水平升高，且是胆囊壁增厚的独立危险因素。其中，棕榈酸（Palmitic Acid, PA）作为FFAs的主要成分，在PBR患者胆汁中显著升高。已知PA在其他癌症（如胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌）中能通过诱导活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）产生来促进癌症的侵袭和转移，但其在胆囊癌中的作用尚不清楚。为此，段宣波（Xuanbo Da）、郭全宇（Quanyu Guo）、卢宇轩（Yuxuan Lu）等研究人员在《Scientific Reports》上发表了他们的研究成果，深入探讨了PA如何影响胆囊癌细胞的迁移能力及其背后的信号通路。

研究人员主要运用了细胞活力检测（CCK-8法）、脂滴染色（油红O染色）、细胞迁移能力评估（Transwell迁移实验和小孔愈合实验）、细胞内ROS和超氧阴离子自由基（O₂·^-）水平检测（使用DCFH-DA和DHE荧光探针结合流式细胞术）、蛋白质和基因表达分析（蛋白质印迹法Western Blot、定量实时聚合酶链反应qRT-PCR）以及蛋白定位观察（免疫荧光法Immunofluorescence）等关键技术方法。研究使用了两种人胆囊癌细胞系NOZ和GBC-SD。

3.1 PA增强人胆囊癌细胞的迁移能力

研究人员首先用不同浓度的PA处理NOZ和GBC-SD细胞，发现PA在0.4 mM和0.8 mM浓度下对细胞有明显的毒性作用，但同时也观察到细胞内脂滴积累随着PA浓度增加而增加。通过Transwell迁移实验，他们发现0.4 mM的PA能显著增强NOZ和GBC-SD细胞的迁移能力。这表明PA能被胆囊癌细胞吸收，并在一定浓度下显著促进细胞迁移。

3.2 PA刺激导致NOZ和GBC-SD细胞中ROS水平上调和NF-κB信号通路激活

为了探究PA促进迁移的机制，研究人员检测了细胞内ROS水平。结果显示，0.4 mM PA处理能显著增加NOZ和GBC-SD细胞中ROS和O₂·^-的水平。进一步研究发现，PA刺激还导致了核因子κB（NF-κB）的关键亚基p65发生明显的核转位，表明NF-κB信号通路被激活。

3.3 NAC抑制PA诱导的ROS水平上调和NRF2/ARE信号通路的激活

ROS的过量产生通常会激活细胞内的抗氧化防御机制。研究人员使用ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine, NAC）进行处理。结果发现，NAC能有效抑制PA引起的ROS和O₂·^-水平升高。同时，免疫荧光实验表明，PA处理能增强转录因子NRF2及其下游靶基因血红素加氧酶-1（HO-1）和醌氧化还原酶1（NQO1）的荧光强度，即激活了NRF2/ARE信号通路，而NAC干预则抑制了NRF2的核转位及其下游靶基因的表达。这表明PA可能通过上调ROS水平激活NRF2/ARE这一抗氧化通路。

3.4 ROS下调抑制NF-κB激活和胆囊癌细胞迁移

为了明确ROS在PA诱导的细胞迁移中的具体作用，研究人员在加入PA的同时使用NAC进行处理。结果显示，NAC预处理能够逆转PA引起的促炎细胞因子白介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的上调，并抑制NF-κB p65的核转位及其磷酸化水平。更重要的是，在蛋白和mRNA水平上，NAC显著降低了PA诱导的上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）标志蛋白N-钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表达，同时上调了E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达。Transwell迁移实验和小孔愈合实验的结果均证实，NAC能显著抑制PA诱导的NOZ和GBC-SD细胞迁移。这些结果表明，PA诱导的ROS上调是促进胆囊癌细胞迁移的关键因素。

综上所述，本研究阐明了胆汁代谢物PA通过诱导ROS过度产生，进而激活NF-κB信号通路和NRF2/ARE信号通路，最终促进胆囊癌细胞发生EMT并增强其迁移能力的分子机制。NF-κB的激活触发了炎症因子释放和EMT进程，而NRF2/ARE通路的激活可能作为一种细胞适应性反应，帮助癌细胞在高ROS环境下存活，两者协同作用增强了胆囊癌细胞的转移潜能。该研究从代谢角度揭示了PBR与胆囊癌发生发展之间的潜在联系，阐明了PA作为胆囊癌早期转移风险因素的作用机制，不仅深化了对PBR相关胆囊疾病分子机制的理解，也为开发针对该通路的新型治疗策略提供了重要的科学依据。