单细胞转录组解析食管鳞癌治疗抵抗中癌症相关成纤维细胞的特异性标志

《Scientific Reports》：Single-cell transcriptomic analysis reveals distinct cancer-associated fibroblast signatures in treatment-refractory esophageal squamous cell carcinoma

本研究针对食管鳞状细胞癌(ESCC)新辅助放化疗(nCCRT)后约半数患者出现治疗抵抗的临床难题，通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术对10例患者的肿瘤和癌旁组织进行深入分析。研究发现淋巴结(LN)浸润状态与特定的肿瘤微环境(TME)特征密切相关：治疗抵抗组显著富集CLEC2BhimyCAF亚型，而治疗敏感组则以F11RhiCD56dimNK细胞为主导。该研究首次揭示了CLEC2B-KLRB1轴在CAF介导的免疫抑制中的潜在作用，为ESCC治疗抵抗机制提供了新的见解和潜在治疗靶点。

　　

食管癌是全球癌症相关死亡的第六大原因，而食管鳞状细胞癌(ESCC)作为亚洲地区的主要组织学亚型，占病例的90%以上。在台湾地区，ESCC尤其影响男性，晚期患者5年生存率低于20%。当前标准治疗方案为新辅助同步放化疗(nCCRT)后手术切除，但治疗抵抗仍是重大临床挑战，约50%患者表现出不完全病理缓解。肿瘤微环境(TME)在ESCC治疗反应和疾病进展中起着关键作用，其中癌症相关成纤维细胞(CAFs)和自然杀伤(NK)细胞被认为是影响治疗效果的重要细胞群体，然而与淋巴结浸润状态相关的特异性细胞特征仍不清楚。

为深入探究这一机制，研究人员在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果。该研究通过对10例接受nCCRT后手术切除的ESCC患者（根据ypTNM分期分为有/无淋巴结浸润两组各5例）的肿瘤和癌旁组织进行单细胞RNA测序分析，结合生物信息学方法系统揭示了治疗抵抗相关的细胞特征和分子机制。

研究采用的关键技术方法包括：单细胞RNA测序(BD Rhapsody平台)技术对47，907个细胞进行转录组分析；Seurat软件进行细胞聚类和差异表达分析；CellChat和CellPhoneDB进行细胞间通讯预测；Monocle2进行伪时间轨迹分析；clusterProfiler进行通路富集分析。样本来源于Taichung Veterans General Hospital经伦理审查批准的临床队列。

单细胞景观揭示显著细胞组成差异

分析发现9个主要细胞群体：成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、壁细胞、T细胞、NK细胞、B细胞、浆细胞和单核细胞。肿瘤区域中，淋巴结浸润组（ presence group）成纤维细胞比例较高（平均52.86%），而无浸润组（absence group）NK细胞百分比显著更高（平均35.86%，p=0.0317）。

治疗相关成纤维细胞和NK细胞亚型的鉴定

通过亚群分析，在成纤维细胞中鉴定出13个亚型，包括肌成纤维细胞样CAFs(myCAFs)、抗原呈递CAFs(ApCAFs)、炎症性CAFs(iCAFs)和正常成纤维细胞(NFs)；在NK细胞中区分出7个亚型，包括未成熟NK(iNK)、CD56^bright、CD56^dim和组织驻留NK(trNK)群体。特别值得注意的是，myCAF_3亚型在浸润组患者中显著富集（平均10.64% vs 0.58%，p=0.0159），而CD56^dimNK_2细胞在无浸润组中比例显著更高（平均19.14% vs 1.73%，p=0.0159）。

治疗相关细胞亚型的分子特征

差异表达分析显示，myCAF_3细胞高表达CLEC2B和KRT13，而CD56^dimNK_2细胞高表达F11R。通路富集分析表明，myCAF_3细胞富集于防御反应负调控、细胞外基质组织和炎症反应等通路，NFKB1作为核心枢纽连接7条显著通路；CD56^dimNK_2细胞则富集于白细胞黏附、白细胞活化和免疫调节等过程，IRAK4作为关键枢纽基因参与11条KEGG通路。

细胞间通讯分析发现myCAF亚型与NK细胞亚群之间存在广泛的双向通讯网络，其中myCAF_3与CD56^brightNK_1细胞表现出最强的CLEC2B-KLRB1相互作用潜力，提示该轴可能参与治疗抵抗微环境的形成。

与临床结果相关的细胞进化模式

伪时间轨迹分析显示，不同组别的细胞在成纤维细胞和NK细胞发育轨迹上占据相反末端，而组织区域（肿瘤vs正常）沿伪时间轴均匀分布，表明淋巴结浸润状态与特定细胞状态相关。

正常组织区域中的细胞异质性

值得注意的是，治疗相关差异延伸至放射野内的癌旁正常区域。浸润组患者ApCAF_1（12.16% vs 3.42%，p=0.0159）和NF_2（12.94% vs 0.05%，p=0.0079）成纤维细胞亚型显著富集，而无浸润组CD56^BRNK_1 NK细胞比例更高（4.85% vs 1.28%，p=0.0317），表明治疗抵抗相关细胞特征具有区域性组织重编程特点。

研究结论表明，ESCC患者淋巴结浸润状态与独特的肿瘤微环境特征相关：浸润组以CLEC2B^himyCAF为特征，可能通过CLEC2B-KLRB1轴抑制NK细胞功能；而无浸润组以F11R^hiCD56^dimNK细胞为主导，表现出增强的细胞毒功能。这些发现为理解nCCRT后不同病理结果的细胞机制提供了新视角，为ESCC治疗中的患者分层和治疗靶点开发提供了潜在生物标志物。

该研究的重要意义在于首次在单细胞水平系统揭示了ESCC治疗抵抗与敏感患者的肿瘤微环境细胞组成和分子特征差异，特别是CLEC2B^himyCAF亚型的鉴定为克服治疗抵抗提供了新的潜在靶点。同时，研究发现治疗相关细胞特征不仅存在于肿瘤区域，还扩展至放射野内的癌旁正常组织，提示区域性组织重编程在治疗反应中的重要性。这些发现为开发针对肿瘤微环境的联合治疗策略和预后预测模型奠定了重要基础。