无血清CHO培养中麦芽糖代谢新机制：溶酶体酸性α-葡萄糖苷酶的关键作用

《Scientific Reports》：Maltose metabolism in serum free CHO culture involves lysosomal acid α-glucosidase

本研究针对哺乳动物细胞培养中碳水化合物来源单一的问题，系统探讨了麦芽糖在CHO-K1细胞中的代谢机制。研究人员通过同位素标记、基因敲除和酶抑制剂实验，首次证实溶酶体酸性α-葡萄糖苷酶（GAA）介导的细胞内麦芽糖水解是其代谢关键途径。该发现为优化生物制药细胞培养工艺提供了新策略，有望通过麦芽糖补充实现细胞高密度培养和重组蛋白产量提升。

　　

在生物制药领域，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是生产重组治疗性蛋白的主要宿主细胞。传统细胞培养工艺中，葡萄糖作为主要碳源易引发乳酸积累，导致培养环境酸化并限制细胞生长密度。近年来，研究者发现二糖类物质麦芽糖能作为替代碳源支持哺乳动物细胞生长，但其在CHO细胞中的具体代谢机制尚不明确。发表于《Scientific Reports》的这项研究，首次揭示了溶酶体酸性α-葡萄糖苷酶（GAA）在CHO细胞麦芽糖代谢中的核心作用，为优化细胞培养工艺提供了全新视角。

研究团队采用多组学联用技术开展机制探索：通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析¹³C标记麦芽糖的代谢流向；利用CRISPR/Cas9技术构建GAA基因敲除（KO）细胞株；结合Western blot验证蛋白表达；采用酶抑制剂（卡斯塔碱/阿卡波糖）进行功能验证。所有实验均使用ATCC来源的CHO-K1细胞株在无血清化学限定培养基中进行。

生长和细胞内二糖谱分析

在含4 g/L葡萄糖的基础培养基中补充10 g/L麦芽糖或海藻糖，发现麦芽糖组细胞密度在96小时达到1×10⁷cells/mL，显著高于海藻糖组。细胞内二糖检测显示，海藻糖在细胞内持续累积至1400 μM，而麦芽糖浓度在48小时达峰值（108 μM）后下降，表明麦芽糖被主动代谢。

同位素示踪验证代谢途径

添加¹³C标记麦芽糖后，乳酸中¹³C-[M+3]同位素体比例在96小时升至6.6%，TCA循环中间体（柠檬酸、琥珀酸、苹果酸）均检测到¹³C标记。而¹³C-海藻糖组标记率不足1%，证实麦芽糖能通过水解生成葡萄糖参与能量代谢。

酶抑制剂靶点鉴定

使用细胞膜通透性GAA抑制剂卡斯塔碱（26.4 μM）时，麦芽糖适应型CHO细胞生长抑制率达37.5%，非通透性抑制剂阿卡波糖无此效应，提示麦芽糖水解发生在细胞内。

基因敲除验证GAA功能

GAA-KO细胞在麦芽糖培养基中细胞内麦芽糖积累量为野生型的3-6倍，且细胞生长受阻。回补GAA基因后，细胞内麦芽糖水平下降至对照组的20%，细胞密度恢复至3.4×10⁶cells/mL。

转运动力学特征

在0-40 g/L麦芽糖浓度范围内，GAA-KO细胞的麦芽糖摄取速率呈线性增长（R²>0.98），未出现饱和动力学特征，提示可能存在高容量转运机制。

本研究通过多维度实验证实：麦芽糖通过未知转运蛋白进入CHO细胞后，由溶酶体酸性α-葡萄糖苷酶（GAA）水解为葡萄糖参与能量代谢。该机制解析了麦芽糖延长细胞培养周期、提高抗体产量的生理基础，为开发二糖补充型无血清培养基提供了理论支撑。针对GAA的代谢工程改造有望成为优化生物工艺的新突破口。