《Nano Today》：Endogenous enzyme-activatable catalytic DNA nanodevice for cancer cell-selective piRNA imaging and regulation
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piRNA检测方法；内源性酶激活型催化DNA纳米装置；细胞特异性成像；APE1酶；肿瘤治疗
秦可|赵家音|马飞|张春阳
东南大学化学与化学工程学院，数字医学工程国家重点实验室，南京211189，中国
摘要
作为新发现的表观遗传调控因子，piwi相互作用RNA（piRNAs）因其在肿瘤发生中的潜在作用而受到越来越多的关注。然而，由于piRNAs在恶性细胞和正常细胞中广泛存在，因此选择性地检测和调控与癌症相关的piRNAs仍然是一个重大挑战。在这里，我们开发了一种内源性酶激活的催化DNA纳米装置（EE-CDN），用于选择性成像和调控piRNAs。EE-CDN在正常细胞中保持惰性状态，从而最小化了非特异性背景信号并避免了不必要的副作用。EE-CDN仅在癌细胞中被激活，从而实现对piRNAs的选择性识别。通过将传感元件锚定在四面体DNA骨架上，EE-CDN能够通过空间限制的催化DNA组装加速piRNAs的检测。利用单分子检测技术，EE-CDN可以达到阿托摩尔级别的灵敏度，从而在细胞模型和临床组织样本中准确区分和亚型化乳腺癌。重要的是，EE-CDN能够在活的乳腺癌细胞和携带乳腺癌的小鼠中实现piRNAs的体内追踪，并具有优异的空间特异性；同时，通过耗尽内源性piRNAs，它还能有效抑制细胞和小鼠模型中的肿瘤生长，为癌症的精确诊断和靶向治疗提供了一个强大的平台。
引言
乳腺癌是女性中最常诊断出的癌症，也是第二大致命的恶性肿瘤[1]，早期发现和干预对于提高生存率至关重要[2]。越来越多的证据表明，piwi相互作用RNA（piRNAs）与癌症的发展密切相关，并在癌症管理中显示出作为诊断和治疗生物标志物的巨大潜力[3]、[4]、[5]。然而，大多数piRNA检测方法只能测量从大量细胞中提取的piRNAs，无法提供piRNAs在天然生物环境中的动态信息，导致无法了解单个细胞之间的piRNAs变异性/异质性[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]。只有少数基于分子信标[12]和3WJ探针[13]的方法可用于监测活细胞中的piRNAs。然而，由于piRNAs不仅存在于癌细胞中，正常细胞中也存在（尽管水平较低[14]），因此选择性地检测和成像piRNAs仍然是一个巨大挑战。因此，现有的“始终开启”的piRNA探针也可能在正常细胞中被激活，导致非特异性信号和低信噪比。
四面体DNA（TD）是最简单的三维（3D）DNA纳米结构，具有高生物相容性、出色的细胞摄取效率和多功能装载能力[15]、[16]，在成像各种癌症生物标志物（如RNA[17]、[18]、蛋白质[19]和酶[20]）方面有广泛的应用。然而，由于大多数生物标志物在正常细胞和肿瘤细胞中普遍存在，基于TD的探针往往会被非特异性激活，这大大降低了检测的灵敏度和特异性。
为了克服这些限制，我们开发了一种由apurinic/apyrimidinic内切酶1（APE1）激活的催化DNA纳米装置（EE-CDN），用于选择性检测piRNAs。APE1是一种关键的DNA修复酶，能够以显著的活性和极高的特异性催化apurinic/apyrimidinic（AP）位点的水解。特别是，APE1在肿瘤细胞的细胞质中过表达，但在正常细胞的细胞核中主要定位[21]，这使其成为构建具有酶控制激活功能的智能DNA纳米装置的理想候选者[22]、[23]。通过利用APE1作为内源性刺激，EE-CDN可以在癌细胞中选择性激活，实现对piRNAs的选择性成像，并提高癌症诊断的准确性。EE-CDN可以成功应用于活的乳腺癌细胞和小鼠模型中piRNAs的可视化，并具有高空间特异性，同时高效抑制肿瘤生长。
EE-CDN的设计与原理
EE-CDN用于选择性成像和调控piRNAs的原理如图1所示。选择四面体DNA（TD）作为构建EE-CDN的骨架，因为它具有优异的生物相容性和出色的细胞摄取效率[15]、[16]。TD的每个顶点都有四个独特的突出部分，由四条单链DNA（即D1、D2、D3、D4，见表S1）组成。其中一个突出部分包含AS1411适配体，可以促进piRNAs的选择性内化
结论
总之，我们开发了一种高度集成的内源性酶激活催化DNA纳米装置EE-CDN，用于piRNAs检测，其性能优异（见表S2）。通过合理设计带有AP位点的识别单元，EE-CDN在正常细胞中保持惰性状态，有效减少了背景信号和不必要的副作用。通过癌症特异性APE1酶的选择性激活，确保了对piRNAs的精确检测和调控。
一般信息
材料与试剂、寡核苷酸（表S1）、凝胶电泳分析、荧光测量、单分子检测、细胞培养、RNA提取、qRT-PCR检测、稳定性分析、MTT检测、活细胞/死细胞染色分析、动物模型建立、组织学分析、伦理批准声明以及补充结果详见支持信息。
EE-CDN的构建
双链DNA探针（T1-T2、T1-nT2和T1-I）是通过混合相应的两条DNA链制备的
CRediT作者贡献声明
秦可：撰写 – 原始草稿、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。赵家音：验证、方法学、研究、数据分析。张春阳：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理、资金获取、数据分析、概念化。马飞：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理、方法学、资金获取、数据分析、概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了江苏省前沿技术研发计划（BF2024063）和国家自然科学基金（22174017）的支持。
