利用一种原创的手性分辨标记试剂，通过同位素编码衍生化方法对血清中的D/L-丝氨酸和D/L-脯氨酸进行定量分析

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis Open》：Quantitative analysis of D/L-serine and D/L-proline in serum by isotope-coded derivatization using an original chiral resolution labeling reagent

D-FDLDA衍生化结合LC-MS单四极质谱法准确测定血清中D/L-丝氨酸和D/L-脯氨酸，AD患者D-型浓度显著升高，方法稳定（4℃保存1月无降解），提取回收率±15%，RSD<10%，为早期非侵入性AD诊断提供新工具。

　　
本研究提出了一种基于同位素标记衍生化的高效液相色谱-单四极杆质谱联用技术（LC–MS），用于准确量化血清中D/L-丝氨酸和D/L-脯氨酸浓度。该方法通过自主研发的D-FDLDA和13C6-D-FDLDA双同位素标记试剂，实现了D-氨基酸的高灵敏分离与定量，为阿尔茨海默病（AD）的早期诊断提供了新思路。

**技术原理与优势**
传统检测方法存在灵敏度不足或设备昂贵的问题。本研究采用"稳定同位素双标记法"：以D-FDLDA标记目标氨基酸的D型异构体，同时使用13C6同位素标记的D-FDLDA作为内标。这种设计既保证了同位素标记的稳定性（样品可冷藏保存1个月不降解），又通过内标校正解决了生物样本基质效应干扰。实验证明，该方法对D-丝氨酸和D-脯氨酸的最低检测限分别达到343.6 nmol/L和150.3 nmol/L，定量重复性误差控制在3%-8%之间。

**方法验证**
通过标准品验证，D/L-丝氨酸和D/L-脯氨酸的线性回归系数均大于0.99，显示良好线性关系。回收率实验表明，D-氨基酸的回收率在104%-107%之间，L-氨基酸在105%-114%之间，均在允许误差范围内。方法的稳定性经28天实验证实，标记产物未发生显著降解或解离。

**临床样本分析**
对健康人群和AD患者血清检测显示：AD患者D-丝氨酸浓度（2.07±0.07 μmol/L）显著高于对照组（1.80±0.06 μmol/L），D-脯氨酸浓度（1.50±0.04 μmol/L）也呈现统计学差异（p<0.001）。特别值得注意的是，AD患者血清中D-氨基酸占总异构体比例（%D）达到1.66±0.11%，显著高于对照组的1.23±0.13%，这一发现与既往CSF中D-氨基酸增高的研究结果相吻合。

**方法学创新**
1. **衍生化试剂设计**：D-FDLDA试剂具有双重优势——既提供D-氨基酸的特异性标记位点，又通过13C6同位素标记实现精准定量。该试剂对丝氨酸和脯氨酸的分离度（Rs值）分别达到12.1和13.5，显著优于传统荧光标记法。
2. **操作简化**：相比需要复杂优化多反应监测（MRM）的LC-MS/MS方法，本技术仅需单四极杆质谱，操作流程更简单。衍生化反应时间仅需2小时，且无需复杂后处理。
3. **跨物种适用性**：实验验证了该方法在人类和小鼠血清中的有效性，D-丝氨酸和D-脯氨酸的浓度范围（0.43-4.78 μmol/L）与既往文献报道一致。

**应用前景与局限性**
该方法在AD诊断中展现出独特价值：通过血清中D-氨基酸比例变化（%D），可实现对早期认知障碍患者的筛查。实验还证实了该方法的跨物种适用性，为动物模型研究提供了标准化检测方案。但需注意，当前研究样本量较小（N=4-5），未来需扩大样本量验证普适性。

**技术拓展方向**
研究团队指出，该方法可通过改变同位素标记模式实现高通量多指标检测。结合PET显像和脑部影像学数据，有望构建AD生物标志物联合诊断模型。此外，衍生化试剂的稳定性（4°C保存1个月）为长期样本存储提供了可能，这对临床队列研究具有重要价值。

本研究为神经退行性疾病提供了新型检测范式，其核心创新在于将同位素标记与高效液相色谱技术结合，既保留了传统衍生化法的高分辨率，又克服了质谱法灵敏度不足的局限。未来可结合机器学习算法，实现多组分生物标志物的自动化分析，推动AD的精准诊疗发展。