开发一种可靠且便捷的侧向流动免疫测定方法，用于检测Ampelopsis grossedentata样品中的二氢杨梅素

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Development of a reliable and convenient lateral flow immunoassay for dihydromyricetin detection in Ampelopsis grossedentata samples

桑叶中二氢杨梅素快速检测方法研究。通过合成3-羧酸基四碳链取代的二氢杨梅素抗原，成功建立特异性单克隆抗体，开发侧流免疫层析法检测新方法，灵敏度达33.61 ng/mL，线性范围4.54-281.83 ng/mL，回收率70.83-96.17%。该方法解决了传统HPLC/LC-MS/MS法成本高、操作复杂的问题，为桑叶茶产业提供快速检测技术。

　　

崔学燕|曹珍|于海龙|李辉|应莹|罗婷|王静

中国农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所农产品质量安全国家重点实验室，北京100081，中国

摘要

二氢杨梅素是一种在分布于中国南部的Ampelopsis grossedentata中丰富的黄酮类化合物，具有多种药理活性。本研究开发了一种精确、灵敏、快速且可靠的侧向流动免疫测定法（LFIA），用于定量Ampelopsis grossedentata中的二氢杨梅素。通过在其3位引入一个四碳链上的羧酸间隔基团，合成了二氢杨梅素半抗原。建立了一种分泌针对二氢杨梅素的高特异性单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞系（2H3）。二氢杨梅素在大多数有机溶剂和酸性条件下表现出良好的稳定性。LFIA的灵敏度（IC??）为33.61 ng/mL，线性范围为4.54–281.83 ng/mL。二氢杨梅素的回收率在70.83–96.17%之间。这些结果表明，利用二氢杨梅素mAb的高特异性，LFIA为Ampelopsis grossedentata中的二氢杨梅素分析提供了一种简单、快速且准确的方法。

引言

Ampelopsis grossedentata（Hand.-Mazz.）W.T. Wang，俗称“藤茶”、“藤茶”或“毛岩梅”，是一种因其营养价值和健康促进作用而受欢迎的传统饮料，其叶片富含黄酮类化合物。这些叶片已成为医药食品研究的重要资源[1]、[2]。近年来，A. grossedentata产业迅速发展[3]；该植物广泛分布于中国南部（湖南、湖北、贵州、广西、福建和广东），并已成为当地扶贫计划的关键作物[4]。

二氢杨梅素（3,5,7,3′,4′,5′-六羟基-2,3-二氢黄酮醇，DMY）最初由Kotake和Kubota于1940年从A. grossedentata叶片中分离出来，是其中的主要黄酮成分[5]。大量研究表明它具有多种药理活性，包括抗炎[6]、抗菌[7]、抗高血压[8]、抗肿瘤[8]、[9]、抗氧化[10]、[11]、[12]、心血管保护[13]、[14]、肝脏保护[15]、[16]、肾脏保护[17]、[18]、调节血浆脂质[16]和血糖水平[19]、[20]、[21]。

为了了解A. grossedentata中DMY含量的区域差异、时间变化和组织特异性分布，需要可靠的分析方法。已有多种技术被报道：高效液相色谱（HPLC）[22]、[23]、超高效液相色谱-高分辨率质谱[24]、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）[25]、[26]、光谱方法和电化学方法[27]。Xia Xuhong [28]使用HPLC测定四个地区的样品中的DMY含量，结果范围为212至362 mg/g。Hu Baishun [29]使用HPLC比较了5月、6月、7月和8月收获的叶片中的DMY含量，发现5月的含量最高。Zhang Shuai [30]研究了组织特异性的DMY分布，不同叶片位置的干重含量分别为236.64、219.13、142.23、123.59和92.67 mg/g，其中卷须中的含量最高（224.25 mg/g），其次是茎（104.41 mg/g）；根部未检测到DMY。这些数据显示出明显的空间和时间模式，即随着叶片年龄的增长，DMY含量降低。Liu Lu的[25]团队开发了一种适用于大鼠血浆的LC-MS/MS方法，检测限（LOD）为0.5 ng/mL，线性范围为0.5–200 ng/mL。Zou等人[27]建立了一种电化学传感器，线性范围为4.0 × 10??–2 × 10?? mol/L，LOD为2 × 10?? mol/L。

尽管这些方法灵敏度很高，但需要昂贵的仪器、劳动密集型的预处理和熟练的人员。因此，迫切需要简单、快速且成本效益高的替代方法来常规测定A. grossedentata中的DMY。侧向流动免疫测定法（LFIA）作为一种广泛采用的免疫测定方法，因其速度快和简单性而在政府和工业领域受到重视；然而，其发展依赖于高质量的抗体。迄今为止，尚未有基于抗体的DMY免疫测定方法被报道。

必须克服三个主要挑战：

1.

DMY的六个羟基在中性或碱性条件下不稳定，可能会在免疫原制备过程中发生降解。

2.

许多结构类似物（相差一个羟基或一个双键）需要设计出能够最大化抗体特异性的半抗原。

3.

与来自农药或毒素的半抗原不同，黄酮类化合物在小鼠体内的免疫原性不确定，因此需要仔细优化免疫剂量。

为了解决这些挑战，我们合成了一种新的DMY半抗原，并系统地研究了其在相关条件下的稳定性。利用所得到的单克隆抗体，我们开发了第一种用于A. grossedentata中快速定量DMY的LFIA。这种测定方法将使农民和企业能够在源头对原材料进行分级，增加农民收入，降低检测成本，并最终推动藤茶产业的发展，同时确保消费者获得更高质量的产品。

试剂和材料

二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷、柚皮苷和槲皮素的分析标准品（纯度≥98%）来自Desite Biotechnology Co.,Ltd.（中国成都）。N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）、卵白蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、Tween-20、Freund’s完全和不完全佐剂、50%（w/v）聚乙二醇、二甲基亚砜（DMSO）等

二氢杨梅素在不同有机溶剂中的稳定性

为了研究二氢杨梅素的偶联条件及Ampelopsis grossedentata的预处理条件，使用HPLC研究了二氢杨梅素的性质。具体来说，将0.5 mg的二氢杨梅素标准品（≥98%）分别溶解在500 μL的甲醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和乙醇中，制备1000 ppm的标准溶液。然后用水相应的有机溶剂稀释这些溶液，得到100 ppm的标准溶液。

结论

在本研究中，通过使琥珀酸酐与二氢杨梅素3位的羟基反应合成了二氢杨梅素半抗原。成功建立了一种分泌针对二氢杨梅素的高特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系（2H3），从而开发出了侧向流动免疫测定法（LFIA）。该测定的IC??为33.61 ng/mL，线性范围为4.54–281.83 ng/mL（20–80%抑制）。抗体显示出的干扰很小

资金来源

本工作得到了国家重点研发计划项目“多场景现场执法快速检测设备及模块化配置”（2022YFF1101003）、国家自然科学基金青年项目“图像识别方法及其光学信号处理机制”（32202177）以及北京工业大学重点科技计划（2024×002-KXZ）的资助。

未引用的参考文献

[38]

CRediT作者贡献声明

李辉：软件、方法学。应莹：验证、研究。罗婷：验证、研究。王静：撰写 – 审稿与编辑、资金获取、概念构思。崔学燕：撰写 – 原稿撰写、方法学、资金获取。曹珍：撰写 – 审稿与编辑、项目管理、研究、资金获取。于海龙：验证、数据管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

我想衷心感谢所有参与实验工作的团队成员。他们的奉献精神、团队合作以及愿意分享专业知识使这项工作成为可能。这项工作确实受益于我们的共同努力。