《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Quantification of Polymyxin E in Plasma and Epithelial Lining Fluid: Validation and Clinical Application
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基于多粘菌素E（PME）窄治疗窗特性，本研究建立并验证了血浆及肺泡灌洗液（ELF）中PE1/PE2的LC-MS/MS检测方法。回顾性分析显示，40例危重患者中谷浓度与急性肾损伤（AKI）呈显著正相关（p=0.021），而峰值浓度与疗效无明确关联。前瞻性队列研究首次证实吸入给药后ELF浓度（中位数2.31 μg/mL）显著高于血浆浓度（中位数1.25 μg/mL），为肺靶向给药提供依据。该分析方法适用于PME个体化给药策略制定。
张胜楠|杨瑞伟|谭宏毅|谢瑞英|李业军|刘静晶|刘春|裴琪
中南大学第三湘雅医院药学系，中国湖南省长沙市410013
摘要
多粘菌素E（PME）是治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的重要“最后手段”抗生素，但其狭窄的治疗窗口和高药代动力学变异性要求进行治疗药物监测（TDM）。在本研究中，我们开发并验证了一种灵敏的LC–MS/MS方法，用于定量接受硫酸多粘菌素治疗的患者的血浆和上皮衬液（ELF）中的PME含量。血浆和支气管肺泡灌洗液样本通过含有0.1%甲酸的乙腈进行蛋白沉淀处理，并在三级四极杆质谱仪上进行分析，验证过程符合FDA/EMA指南。对40名重症患者的血浆样本进行回顾性分析后发现，有急性肾损伤（AKI）和没有急性肾损伤患者的血浆谷浓度存在显著差异（中位数分别为1.50 μg/mL和0.79 μg/mL，p = 0.021），但未观察到与临床疗效的明显相关性。在一个前瞻性队列研究中，四名患者的配对血浆和ELF数据表明，吸入给药后的ELF浓度明显高于血浆浓度，这为硫酸多粘菌素吸入后肺部药物暴露提供了首个临床证据。总体而言，这种经过验证的方法适用于PME的常规TDM。研究结果为未来评估血浆谷浓度和ELF浓度以指导重症患者的个性化治疗提供了依据。
引言
多重耐药（MDR）革兰氏阴性菌的出现，特别是碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌，给治疗带来了巨大挑战。因此，曾经因毒性问题而被弃用的多粘菌素重新被引入临床实践，作为最后一线抗生素[1]、[2]、[3]。其中，多粘菌素E（PME，即硫酸多粘菌素）是一种关键的治疗选择。其临床制剂主要包括多粘菌素甲酸盐钠（CMS，一种需要体内水解转化为活性多粘菌素的活性前体）和硫酸多粘菌素（本身具有活性）[4]、[5]、[6]。硫酸多粘菌素主要由多粘菌素E1（PE1）和多粘菌素E2（PE2）组成，两者占总含量的85%以上。在治疗药物监测（TDM）中，通常使用PE1和PE2的联合浓度作为多粘菌素暴露的替代指标[7]、[8]、[9]。
由MDR革兰氏阴性菌引起的呼吸机相关肺炎和医院获得性肺炎是硫酸多粘菌素治疗的最常见适应症[10]、[11]、[12]。然而，静脉注射（IV）给药常受到肺部组织渗透性差以及肾毒性和神经毒性的限制[13]、[14]、[15]。因此，吸入给药被认为是一种有前景的辅助方法，旨在绕过全身循环的局限，将高浓度的药物直接输送到感染部位，从而可能降低全身毒性[11]、[12]、[16]、[17]。尽管吸入多粘菌素在临床应用中越来越普遍[18]，但在上皮衬液（ELF）中的药代动力学数据仍然很少，且没有研究报道硫酸多粘菌素吸入后的ELF药物暴露情况。这种证据不足阻碍了基于证据的剂量策略的开发和优化[19]、[20]、[21]、[22]。
此外，由于多粘菌素具有多阳离子肽结构，在生物分析样品制备和检测过程中容易发生非特异性吸附，这对定量准确性和重复性构成了重大挑战[23]、[24]、[25]。早期的尝试，如Landersdorfer等人的研究[21]，采用了高效液相色谱（HPLC）结合固相萃取、衍生化和荧光检测来定量血浆和支气管肺泡灌洗液中的多粘菌素和CMS。然而，这些方法劳动强度大、依赖试剂，并且无法区分不同的多粘菌素成分，限制了其在常规临床监测中的应用。
鉴于这些限制，本研究旨在建立并验证一种简单、灵敏的LC-MS/MS方法，能够可靠地定量血浆和ELF中的PE1和PE2。基于这一分析平台，我们进一步探讨了接受硫酸多粘菌素治疗患者的系统暴露、临床疗效和毒性之间的关系，并首次描述了吸入给药后的ELF暴露情况。这些发现为优化、基于证据的个性化硫酸多粘菌素治疗策略提供了实验依据。
标准品和试剂
硫酸多粘菌素购自CFWLABs Inc.（美国特拉华州纽瓦克）。多粘菌素B参考标准品（作为内标IS）购自上海第一生化药业有限公司（中国上海）。乙腈（HPLC级）和甲醇（MeOH，HPLC级）购自默克公司（德国达姆施塔特）。甲酸（FA，HPLC级）购自ACS公司（美国特拉华州威尔明顿）。三氯乙酸（TCA，分析级）购自中国医药化学试剂公司
质谱和色谱条件
IS、PE1和PE2的跃迁数据是通过MS
2扫描模式获得的，参数基于前体-产物离子对的MRM分析进行优化。选定的定量跃迁分别为PE1的m/z 585.1 → 101.2、PE2的m/z 578.6 → 100.8以及内标PB1的m/z 602.6 → 241.3。PE1、PE2和IS的详细质谱参数见表1。在当前色谱条件下，LC-MS/MS分析的总运行时间为7分钟
结论
本研究开发并验证了一种能够同时定量接受硫酸多粘菌素治疗患者血浆和ELF中PE1和PE2的LC–MS/MS方法。该方法表现出优异的灵敏度、准确性和稳定性，适用于临床TDM。在回顾性临床队列研究中，血浆PME浓度与疗效无显著关联，但升高的稳态谷浓度与急性肾损伤风险增加显著相关。
资助
本研究得到了非传染性疾病-国家科学技术重大项目（项目编号2024ZD0533000）和中国国家自然科学基金（项目编号82373966）的支持。
作者贡献声明
杨瑞伟：撰写——初稿、数据可视化、验证、软件开发、实验设计、数据管理。
谭宏毅：撰写——审稿与编辑、验证、资源协调、方法学设计。
谢瑞英：验证、软件开发、实验设计。
李业军：验证、方法学设计。
刘静晶：数据分析、数据管理。
刘春：撰写——审稿与编辑、数据分析、概念构思。
裴琪：撰写——审稿与编辑、项目监督、方法学设计、资金管理
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究工作的财务利益或个人关系。
