《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》：Small-scale siRNA screen reveals WWC2 as a novel regulator of cardiomyocyte mitosis
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心肌细胞增殖调控机制研究：通过转录组比较发现WWC2通过14-3-3蛋白调控YAP磷酸化影响细胞周期退出，促进心脏再生。
Dogacan Yücel|Calvin Smith|Natalia Ferreira de Araujo|Fernando Souza-Neto|Upendra Chalise|Grace Schuler|Bayardo I. Garay|Jennifer L. Mikkila|Omar Atef Abdelhamid Mahmoud|Pratima Mandal|Rita C.R. Perlingeiro|Jop H. van Berlo
美国明尼苏达大学综合生物学与生理学系
摘要
总结（145字）
成年心肌细胞在出生后不久就会退出细胞周期，尽管这种变化可以通过分子干预来逆转。为了识别新的心肌细胞增殖调节因子，我们对处于活跃增殖状态和非增殖状态的心肌细胞在关键的产前和产后发育时间点进行了比较转录组分析。通过整合生物信息学分析与238个差异表达基因的功能筛选，我们发现WWC2是细胞周期退出的调节因子。抑制WWC2可诱导细胞进入细胞周期并完成有丝分裂和胞质分裂，而WWC2的过表达则会促使细胞退出细胞周期。此外，抑制WWC2会导致心肌细胞去分化，表现为肌节相关基因和钙处理基因的表达减少。从机制上看，WWC2与14-3-3蛋白结合，并调节YAP蛋白的磷酸化及表达。在体内实验中，敲除WWC2可促进心肌梗死后的心脏再生。这些结果表明WWC2是心肌细胞周期退出和成熟过程启动的重要调节因子。
引言
心血管疾病是全球主要的死亡原因[1]。许多心脏疾病的共同特征是心肌细胞大量丢失，从而导致心力衰竭和射血分数降低（HFrEF）[2]。成年心脏的有限再生能力是一个重大的治疗挑战，因为成熟的心肌细胞已经经历了有丝分裂，无法在生理条件下补充丢失的心肌[3,4]。
心肌细胞从增殖状态向有丝分裂后状态的转变遵循一个明确的发育轨迹[5]。虽然胚胎期的心肌细胞容易增殖，但这种能力在出生后很快就会减弱[6]。出生后早期的心肌细胞首先失去完成胞质分裂的能力，同时仍保持DNA合成能力，从而导致内复制[7]。随后，这些细胞完全退出细胞周期，标志着它们的最终分化[5]。
最近的研究表明，分子干预可以恢复成年心肌细胞的增殖能力[[8], [9], [10], [11]]。这些增殖信号通常会引发部分去分化，表现为肌节的解体以及转录回类似胚胎的状态[12,13]。这一观察结果表明，成功使心肌细胞重新进入细胞周期需要激活发育相关程序。在这里，我们通过比较具有胞质分裂能力的胚胎期心肌细胞和胞质分裂受阻的成年心肌细胞，来识别心肌细胞增殖的关键调节因子。我们从这些分析中鉴定出的主要基因是WWC2（WW和C2结构域包含的蛋白2），它是一种调节Hippo信号通路的适配蛋白[14,15]。尽管在其他系统中已经发现WWC2可以通过激活Hippo通路来抑制YAP1的活性[16]，并且YAP1在胚胎和成年心脏中都是已知的心肌细胞增殖调节因子，但WWC2在心肌细胞周期活动中的直接作用尚未得到研究。
研究片段
RNA测序
对于体内RNA测序，我们按照先前的方法[30]，从胚胎第15.5天（E15.5）、出生后第1天（P1）和出生后第7天（P7）的灌注固定心脏中分离出单个心肌细胞（CMs）。分离出的CMs用抗磷酸组蛋白H3（pHH3；Abcam，ab10543）和心脏肌钙蛋白T（TnnT；Thermo Fisher Scientific，MA5–12960）抗体以1:200的比例在4°C下染色1小时。抗体溶解在含有0.1% Triton-X和2% BSA的PBS中。
转录组分析揭示了发育过程中心肌细胞增殖的动态变化
为了识别新的心肌细胞（CM）增殖调节因子，我们对FACS分选的、处于活跃增殖状态（pHH3+，即磷酸化组蛋白H3阳性）和非增殖状态（pHH3-）的小鼠心肌细胞在三个关键发育阶段（胚胎第15.5天（E15.5）、出生后第1天（P1）和出生后第7天（P7）进行了RNA测序（图1A）。分选后的CMs保持了其形状并显示出完整的形态（补充图1A）。我们观察到pHH3的定位和细胞形态存在不同的染色模式。
讨论
在这项研究中，我们通过比较不同发育阶段（E15.5、P1和P7）活跃增殖和非增殖状态的心肌细胞的转录组，旨在识别新的心肌细胞增殖调节因子。我们的分析揭示了细胞增殖过程中基因表达的动态变化，并确定WWC2是心肌细胞增殖的关键调节因子。转录组分析的一个显著发现是上调基因的数量显著增加。
CRediT作者贡献声明
Dogacan Yücel：撰写初稿、数据可视化、方法设计、实验设计、数据分析、概念构建。Calvin Smith：实验设计。Natalia Ferreira de Araujo：数据可视化、实验设计、数据分析。Fernando Souza-Neto：方法设计、实验设计、数据分析。Upendra Chalise：数据可视化、实验设计、数据分析。Grace Schuler：实验设计。Bayardo I. Garay：方法设计、实验设计。Jennifer L. Mikkila：
利益冲突声明
作者在撰写本手稿过程中未使用生成式AI或AI辅助技术。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院（R01HL155993和R01HL160665）的支持，J.H.v.B.获得了美国心脏协会的博士后奖学金支持。F.S.N.、U.C.、B.I.G.和J.L.M.分别得到了美国国立卫生研究院（T32HL144472、T32GM156735、T32AR007612）的资助。
