马甲子T2T单倍型基因组揭示鼠李科进化与抗病/抗逆分子机制

《Communications Biology》：Haplotype-resolved t2t genome of paliurus hemsleyanus provides insights into rhamnaceae evolution and genome biology

本研究针对鼠李科重要树种马甲子(Paliurus hemsleyanus)基因组资源匮乏的问题，通过PacBio HiFi+ONT+Hi-C技术构建了首个单倍型分型的T2T无间隙基因组（两个单倍型分别为306.65/306.21 Mb）。研究发现鼠李科基因组结构相对稳定，NLR抗病基因呈现根组织优势表达模式，等位基因表达与序列变异正相关；抗坏血酸代谢基因在叶片高表达，MDHAR基因家族在鼠李科发生谱系特异性串联扩增。该高质量基因组为鼠李科进化研究和分子育种提供了关键资源。

　　

在植物基因组学研究日新月异的今天，鼠李科植物作为重要的经济树种和生态树种，其基因组资源却相对匮乏。马甲子(Paliurus hemsleyanus)作为中国特有落叶灌木或小乔木，不仅具有生态韧性、经济价值和观赏价值，更是枣树(Ziziphus jujuba Mill.)的优选砧木，能显著提高接穗对枣疯病的抗性。然而，由于缺乏高质量的基因组参考序列，人们对该物种的基因组生物学和进化历史的认识一直受限。

为了解决这一难题，河北农业大学的研究团队在《Communications Biology》上发表了最新研究成果。他们采用多种前沿测序技术，成功构建了马甲子单倍型分型的端粒到端粒无间隙基因组，为鼠李科植物进化研究和功能基因组学分析提供了高质量参考。

研究人员首先通过PacBio HiFi、Oxford Nanopore超长读长和Hi-C技术，构建了两个单倍型基因组（HapA 306.66 Mb，HapB 306.21 Mb），contig N50均超过24.9 Mb。评估显示基因组完整性达98.90%，LAI指数超过18.5，QV值高于51.4，证实了组装的高质量。所有着丝粒和端粒区域均被完整预测，共注释到约29,000个蛋白编码基因。

单倍型分型T2T基因组组装与验证

通过整合多组学数据，研究人员成功将contig锚定到12条染色体上，Hi-C互作图谱显示清晰的染色体对角线信号。BUSCO分析显示两个单倍型均具有98.90%的完整性，Merqury评估显示碱基错误率低于0.0001。着丝粒预测显示其大小为100 kb-2 Mb，主要由LTR反转录转座子主导。

重复序列和蛋白编码基因注释

重复序列占基因组的47.37%-47.57%，其中转座元件(TE)是主要组成部分。Gypsy和Copia是含量最丰富的LTR反转录转座子。基因表达分析显示，约66%的基因在至少一个组织中表达，表达模式在两个单倍型间高度相似。

单倍型间变异和等位基因特异性表达

共鉴定到1,295,745个SNP和348,631个Indel，影响66.66%的蛋白编码基因。等位基因特异性表达(ASE)分析发现829对基因存在显著表达差异，这些基因富集于防御反应和应激相关过程。表达差异与序列变异程度呈正相关，启动子区域变异对表达影响尤为显著。

特别值得注意的是精氨酸琥珀酸合酶基因ASS1的等位变异：HapA中的PhAASS1具有功能，而HapB中的等位基因因第一外显子插入285 bp而失活。这一发现揭示了结构变异如何驱动等位基因特异性表达，进而影响代谢灵活性。

马甲子与近缘物种的比较基因组学进化见解

与19个物种的比较基因组分析显示，鼠李科物种保持12条染色体的稳定核型，而蔷薇科物种染色体数目变异较大。Ks和4DTv分析揭示了共享的古代全基因组三倍化事件(γ事件)，以及蔷薇科和胡颓子科中特异的全基因组复制事件。鼠李科物种仅保留较小的物种特异性复制峰，表明其基因组进化相对保守。

马甲子NLR基因的表达谱和特征

共鉴定到853个NLR基因，分为CNL、NL、TNL和RNL四个亚家族。表达分析显示NLR基因在根组织中优势表达，特别是在中等表达水平(FPKM 10-100)范围内。等位NLR基因的表达显著高于非等位基因，表明保留两个单倍型具有转录优势。

转座元件分析显示，与全基因组模式不同，Copia元件在NLR基因周围占主导地位。TNL亚家族携带的TE数量显著多于其他亚家族，且TE丰度与TNL在茎叶中的表达呈负相关，但在根中无此相关性，提示根组织可能存在特异性调控机制。

HapB染色体9上约246 kb的缺失导致13个串联NLR基因丢失，这些基因完全不表达，为非等位NLR表达降低提供了典型案例。鼠李科物种间NLR库比较显示显著变异，其中Sth物种的NLR数量极少(68个)，但RNL数量与马甲子相当，表明RNL在鼠李科中具有独特的进化轨迹。

AsA代谢途径的表达和进化

鉴定到91个AsA代谢相关基因，其中L-半乳糖和D-半乳糖醛酸途径在根、茎、叶中占主导地位。生物合成基因在茎叶中的平均表达显著高于根，与AsA含量测定结果一致（叶片含量最高）。

MDHAR基因家族在鼠李科中发生谱系特异性串联扩增，其中枣树扩张最为显著(13个基因)。比较分析显示，这种扩张模式为鼠李科特有，其他高AsA物种如猕猴桃和柑橘中未见类似扩张。

研究结论与意义

本研究提供的马甲子单倍型分型T2T基因组填补了鼠李科基因组资源的空白。研究发现鼠李科基因组结构相对稳定，NLR基因呈现根组织优势表达模式，等位基因表达与序列变异正相关。AsA代谢在叶片中最为活跃，MDHAR基因家族的谱系特异性扩张可能增强了鼠李科植物的抗逆能力。

该基因组为鼠李科植物的进化研究、功能基因组学和分子育种提供了宝贵资源，对未来比较基因组学研究和育种策略制定具有重要指导意义。特别是对NLR和AsA代谢基因的深入分析，为理解植物抗病抗逆机制提供了新视角。

关键技术方法

研究采用PacBio HiFi（41.7×）、Oxford Nanopore超长读长（180×）和Hi-C（201×）技术进行基因组测序，使用MGISEQ-2000平台进行基因组长短读长测序（71×）。利用改进的CTAB法从年轻叶片提取基因组DNA，从同一马甲子个体的根、茎、叶组织（各3个生物学重复）提取RNA进行转录组测序。通过Hi-C数据辅助染色体构建，使用BUSCO、Merqury和LAI指数评估基因组质量。