MsmCAR对4-羟基戊酸的高度特异性使得能够从生物质来源的左旋戊二酸高效地生产1,4-戊二醇

《Journal of Biotechnology》：High specificity of MsmCAR toward 4-hydroxyvaleric acid enables efficient 1,4-pentanediol production from biomass-derived levulinic acid

生物合成领域，通过筛选10种羧酸还原酶（CARs）发现MsmCAR对4-羟基戊酸具有高特异性，构建表达该酶的整细胞催化系统，并引入Corynebacterium glutamicum的ppk2b和Acinetobacter sp.的chnD基因以再生辅因子，系统优化后最大产率达78.10 mM，生产速率1.86 mM/h。研究成功将底物范围扩展至 Levulinic Acid，为可持续生产短至中链二醇提供了新策略。

　　

崔秀姫（Suhye Choi）| 李承勋（Seung Hun Lee）| 金允英（Yunyeong Kim）| 鄭宇英（Woo Young Jeon）| 安正玉（Jung Oh Ahn）| 沙希·坎特·巴蒂亚（Shashi Kant Bhatia）| 崔权英（Kwon-Young Choi）| 张周正（Joo Jeong Chan）| 杨永勋（Yung-Hun Yang）

韩国首尔建国大学工程学院生物工程系

摘要

烷二醇是一类具有多种应用领域的工业化合物。然而，C5二醇的生物合成受到羧酸还原酶（CARs）对短链至中链底物特异性和效率较低的制约。我们开发了一种全细胞生物转化系统，用于高效生产1,4-戊二醇（1,4-PDO），旨在构建一种二醇生物合成的平台路径。通过筛选10种CARs，我们发现来自Mycolicibacterium smegmatis MC2 155的MsmCAR对4-羟基戊酸（4-HV）具有最高的生物合成效率。我们构建了一种表达MsmCAR的全细胞催化剂，并通过引入来自Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的ppk2b和来自Acinetobacter sp.的chnD（这两种蛋白参与辅因子的再生）来提升其性能。通过对反应条件（包括缓冲液、辅因子、金属离子和培养参数）的系统性优化，当使用4-HV作为底物时，1,4-PDO的最大浓度达到了78.10 mM，产率为1.86 mM/h。为了扩展底物范围至左旋丁内酯，我们引入了3-羟基丁酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的生物合成基因。该系统在10小时内可生产出22.10 mM的1,4-PDO。本研究突显了MsmCAR作为多功能生物催化剂的潜力，并为利用生物质原料生产短链至中链二醇提供了可持续的策略。

引言

烷二醇是一类具有重要价值的中间体，广泛应用于增塑剂、包装材料、体育器材、保湿剂和医疗设备等领域（Bannister和Prather, 2023; Stadler等, 2020; Zhou等, 2021）。这类化合物含有两个羟基和一个碳骨架，使其成为多种工业材料的多功能构建块（Kim等, 2023; Yoo等, 2022）。目前，烷二醇主要通过使用金属还原剂和有机溶剂进行化学还原从石油基原料中制备（Rozenblit等, 2016）。然而，这些过程对环境具有不可持续性，因为它们会加剧全球变暖并释放有害物质。因此，人们正在努力开发更环保的替代方案（Cen等, 2022; Cen等, 2021; Kim等, 2023; Liu等, 2022）。 利用羧酸还原酶（CARs）进行生物合成已成为一种有前景的方法（Khusnutdinova等, 2017a; Winkler, 2018）。CARs可以作用于多种羧酸底物，在某些情况下甚至可以作用于含胺的化合物（Bang等, 2023; Shi等, 2023; Wu等, 2022）。鉴于其广泛的底物适应性，许多研究试图建立基于CAR的合成路径以转化多种原料（Aleku等, 2022; Horvat和Winkler, 2020）。然而，尽管CARs具有多功能性，但它们对短链至中链羧酸的转化效率通常较低，这限制了它们的实际应用（Aleku等, 2022; Lu等, 2022; Stadler等, 2020）。因此，成功构建基于CAR的合成路径需要识别对目标底物具有高特异性的CARs或优化能够提高CAR活性的反应条件。 因此，我们研究了1,4-戊二醇（1,4-PDO）的生产。1,4-戊二醇是一种短链二醇，可作为聚合物和精细化工行业的多功能化学品（Liu等, 2022; Stadler等, 2020）。尽管1,5-戊二醇（1,5-PDO）已得到广泛研究，但关于1,4-PDO的研究仍然较少。在少数关于1,4-PDO生物合成的报告中，只有一项研究对其产量进行了定量测定，结果远低于1 g/L（表1，Liu等, 2022）。据我们所知，此前没有研究实现高产量的1,4-PDO生产，也没有发现对1,4-PDO具有强选择性的CAR（Horvat和Winkler, 2020; Liu等, 2022; Wu等, 2022）。为填补这些空白，我们通过系统性的酶筛选、路径工程和反应优化，建立了从4-羟基戊酸（4-HV）和左旋丁内酯（LA）高效生产1,4-PDO的全细胞平台。图1概述了本研究中采用的整体策略，从CAR筛选到高产量生产及底物扩展的主要步骤。我们期望这一框架可以普遍应用于不同底物的CAR反应。

试剂

用于菌株构建的DNA聚合酶、限制性内切酶和DNA连接酶购自Enzynomics（韩国大田）。用于质粒提取的Exprep Plasmid SV购自GeneAll（韩国首尔）。

用于培养和全细胞1,4-PDO生产的腺苷5′-三磷酸二钠盐（>98%）、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐（还原形式，>90%）、氢氧化钠（>96.0%）和磷酸二氢钠（>98.0%）均购自Tokyo Chemical。

高效生产C5二醇的CAR选择

选择对4-HV具有高特异性的CAR对于高效生产1,4-PDO至关重要。然而，目前已知的CAR类型很少，且它们对羟基羧酸的底物特异性研究不足（Horvat和Winkler, 2020; Shi等, 2023）。为弥补这一知识空白，我们对来自不同菌株的10种CAR进行了比较研究（Khusnutdinova等, 2017）。我们构建了10种重组菌株，每种菌株都携带了来自不同来源的car基因。

结论

在本研究中，我们通过鉴定对羟基酸具有高活性的CAR并优化全细胞系统来提高1,4-PDO的生物合成效率。在筛选的10种CAR中，来自M. smegmatis的MsmCAR（MSM5586）对4-HV表现出最强的底物选择性。基于这一结果，我们构建了一种表达MsmCAR的全细胞催化剂，并通过引入ppk2b和chnD以及系统优化反应参数来提升其性能。

资助

本研究还得到了韩国国家研究基金会（NRF）[NRF-2022R1A2C2003138]以及韩国贸易、工业与资源部（MOTIR）资助的技术创新计划（00467186,20024176, 20025698和RS-2025-25413062）的支持。

CRediT作者贡献声明

金允英（Yunyeong Kim）： 实验研究、数据分析。 崔权英（Kwon-Young Choi）： 文章撰写、审稿与编辑。 沙希·坎特·巴蒂亚（Shashi Kant Bhatia）： 文章撰写、审稿与编辑。 安正玉（Jung Oh Ahn）： 数据验证、方法学研究。 郑宇英（Woo Young Jeon）： 数据验证、方法学研究。 杨永勋（Yung-Hun Yang）： 文章撰写、审稿与编辑、指导。 张周正（Joo Jeong Chan）： 文章撰写、审稿与编辑。 李承勋（Seung Hun Lee）： 数据可视化、实验研究、数据分析。 崔秀姫（Suhye Choi）： 初稿撰写、实验研究、数据管理、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。