八朔橘果皮中新型萜类化合物的发现及其抗胶质母细胞瘤活性研究

《Journal of Natural Medicines》：Three new terpenoids from the fruit peels of Citrus Hassaku Yu.Tanaka

本研究针对八朔橘(Citrus hassaku)果皮中未被充分开发的生物活性成分，通过系统的植物化学分离与结构鉴定，成功分离出三种新型萜类化合物（两种柠檬苦素类似物及一种艾雷莫芬型降倍半萜对映体），并首次报道其中一种化合物（12-nor-11S-hydroxy-11-hydronootkatone）对人胶质母细胞瘤U-251 MG细胞具有弱抗增殖活性。该研究为柑橘属植物资源的高值化利用及抗肿瘤先导化合物的开发提供了新线索。

　　

在柑橘属植物的广阔家族中，八朔橘（Citrus hassaku Yu. Tanaka）作为一种在日本广泛种植却研究相对较少的品种，其果皮中蕴藏的天然活性成分一直未被充分挖掘。柑橘类水果自古以来便是药食同源的典范，富含黄酮类、类胡萝卜素、柠檬苦素（limonoids）、香豆素等多种生物活性成分，这些成分已被证实具有抗肿瘤、抗病毒、抗突变等药理作用。然而，针对八朔橘特定物种的深入研究，尤其是其抗肿瘤活性的物质基础探索，仍存在空白。胶质母细胞瘤作为最具侵袭性的脑肿瘤之一，其治疗手段有限，预后极差，开发新型抗增殖药物迫在眉睫。为此，研究人员将目光投向了八朔橘果皮，旨在从中寻找具有抗胶质母细胞瘤潜力的新型天然化合物。

本研究发表在《Journal of Natural Medicines》上，团队通过现代植物化学分离技术结合多种光谱学方法，对八朔橘果皮的甲醇提取物进行了系统研究。他们采用乙酸乙酯和正丁醇分段萃取，综合运用正相、反相硅胶柱色谱以及高效液相色谱（HPLC）进行分离纯化。在结构鉴定方面，运用高分辨质谱（HR-ESI-MS）、核磁共振（NMR，包括 ¹H, ¹³C, COSY, HMBC, NOESY）确定了新化合物的平面结构和相对构型。绝对构型的确定则结合了计算电子圆二色谱（ECD）和修饰的Mosher法。活性评价则通过WST-8法检测化合物对人胶质母细胞瘤U-251 MG细胞增殖的抑制作用。

结果

从八朔橘中分离得到14个化合物

研究人员从八朔橘果皮的甲醇提取物中成功分离出14个化合物，其中包括3个新化合物：1-乙酰基-球果柠檬苦素酸I (1-acetyl-sphaerocarpainic acid I, 1)、1-乙酰基-球果柠檬苦素I (1-acetyl-sphaerocarpain I, 2) 和12-去甲-11^S-羟基-11-氢诺卡酮 (12-nor-11^S-hydroxy-11-hydronootkatone, 9)，以及11个已知化合物（3-14）。分离产率极低，凸显了新化合物的稀有性。

1-乙酰基-球果柠檬苦素酸I、1-乙酰基-球果柠檬苦素I和12-去甲-11S-羟基-11-氢诺卡酮(1, 2和9)的结构

化合物1和2被鉴定为新的诺米林（nomilin）型柠檬苦素。通过详细的NMR数据分析（见表1），并与已知化合物球果柠檬苦素I (sphaerocarpain I) 对比，确定了其基本骨架。关键区别在于C-1位连接了乙酰氧基（化合物1和2）以及C-3位为甲酯（化合物2）。HMBC和COSY谱图（图2）清晰地揭示了各片段之间的连接。NOESY谱图（图2）用于确定相对构型。最终，通过计算ECD谱图（图3A）与实验数据的对比，并结合生物合成途径分析（通过化学转化关联到已知构型的甲基诺米林酯(5)），确定了化合物1和2的绝对构型为1^S,5^S,8^R,9^R,10^S,13^S,14^R,15^S,17^S。

化合物9被鉴定为一种新的艾雷莫芬型（eremophilane-type）降倍半萜对映体。其NMR数据（表1）与诺卡酮（nootkatone, 10）相似，但缺少C-12，并在C-11位连有羟基和氢，形成1-羟乙基结构。2D NMR（COSY, HMBC）确定了其平面结构（图2）。其C-11位的绝对构型通过修饰的Mosher法确定：将化合物9分别与(R)-和(S)-MTPA氯反应生成酯9a和9b，通过比较其¹H NMR化学位移差值（Δδ_H= δ_S-ester- δ_R-ester）（图4），确定为11^S构型。结合CD光谱与已知构型的诺卡酮对比，最终确定其绝对构型为4^R,5^S,7^R,11^S。

抗增殖效果评估

利用WST-8法评估了所有分离化合物（1-14）对人胶质母细胞瘤U-251 MG细胞的抗增殖活性。结果表明，在30 μM浓度下，只有化合物9表现出弱的抗增殖活性，将细胞增殖抑制至75.3 ± 6.1%（与对照组相比）。阳性对照阿霉素（adriamycin, 1.7 μM）的抑制率为55.0 ± 1.88%。其他化合物在此浓度下未显示显著活性。

结论与讨论

本研究成功从八朔橘果皮中分离并鉴定了三种新的萜类化合物，丰富了柑橘属植物的化学成分多样性。特别是化合物9，作为结构新颖的艾雷莫芬型降倍半萜，首次被报道具有抗人胶质母细胞瘤U-251 MG细胞的活性，尽管活性较弱，但为后续结构优化和活性研究提供了新的先导化合物。研究中所采用的综合光谱解析、计算化学（ECD计算）和化学衍生化（Mosher法）策略，为复杂天然产物绝对构型的确定提供了可靠范例。该研究不仅深化了对八朔橘药用价值的认识，也为从传统药用植物中寻找抗肿瘤药物先导化合物提供了科学依据。未来需要进一步开展体内药效学、毒性评价及作用机制研究，以全面评估其 therapeutic potential。